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1、乳糖操纵子的诱导原理 中心法则 (the central dogma) D N A R N A 蛋 白 质复 制转 录 翻 译逆 转 录R N A复 制基因表达 (gene expression)-基因转录及翻译的过程。产生各种 RNA(tRNA、 mRNA、 rRNA)和各种蛋白质多肽链。 RNA(tRNA、 mRNA和 rRNA 基因的表达方式 根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为： 组成型表达 诱导和阻遏表达 组成型表达 （ constitutive gene expression） 在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中 持续进行 的基因表达， 无论表达的水平高或低 ，它
2、受环境因素的影响较少 、 或变化很小 。 且基因表达产物通常是对生命过程 必需 的、必不可少的，这类基因通常被称为持家基因（ housekeeping gene）。 诱导和阻遏表达 诱导 （ induction）： 在 特定的环境信号 刺激下，相应基因被激活，从而使基因的 表达产物增加 。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为 诱导 (induction)。 乳糖 利用乳糖的三种酶表达 阻遏（ repression）： 在 特定环境信号 刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的 表达产物减少 。这类基因称为可阻遏基因。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为 阻遏 (r
3、epression）。 协调表达 (coordinate expression) 在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需 协调一致、共同表达 ，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达 (coordinate expression)，这种调节称为协调调节 (coordinate regulation)。 乳糖操纵子的结构和功能 操纵子模型的提出 1960-1961年， 莫洛 (Monod)和雅各布 (Jacob)首次提出“操纵子”学说。 获 1965年诺贝尔生理学和医学奖 1940年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，
4、细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。 操纵子（ operon)： 很多 功能相关 的 结构基因串联 排列在染色体上，由一个 共同的控制区 来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。 操纵子的组成： -结构基因 (structural gene, SG) ：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因 -启动子 (promoter， P)：是指能被 RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。 -操纵基因 (operator， O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。 阻遏物基因 (i
5、nhibitor,I),产生阻遏物 (repressor)。 乳糖操纵子的结构和功能 三个特异性序列： 操纵序列 O (operator): 阻遏蛋白结合位点。 启动子 P (promoter): 位于结构基因的上游。 CAP结合位点：环 cAMP受体蛋白 (分解代谢物激活蛋白 )结合位点。 一个调节基因 lac I：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。 乳糖操纵子的结构和功能 结构基因 Z编码 -半乳糖苷酶： 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 Y编码 -半乳糖苷透过酶： 使外界的 -半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码 -半乳糖苷乙酰基转移酶： 乙酰辅酶 A上的乙
6、酰基转到 -半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 乳糖操纵子的结构和功能 当一个 mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的 mRNA称之 多顺反子 mRNA。 多顺反子 mRNA在细菌中是很普遍的。 多顺反子 lac mRNA中的 lacZ， lacY， lacA经翻译生成的产物分别生成代谢分解乳糖的三种酶 始终存在着一定的比例关系 ( Z : Y : A = 5 : 2 : 1 ) 乳糖操纵子的结构和功能 乳糖操纵子的结构和功能 lacZ、 Y、 A基因的转录是由 lacI基因指令合成的阻遏蛋白 R所控制。 lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自
7、己的启动子和终止子，成为 独立的转录单位 。 由于 lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的 DNA位点上。 乳糖操纵子的结构和功能 阻遏蛋白的 负 调控 (negative control of repressor) 阻遏蛋白的 负 调节 (negative control of repressor) 无乳糖 (no lactose): lac操纵元处于阻遏状态 (repression) 有乳糖 (presence of lactose)： lac操纵元即可被诱导(derepression,induction) 诱导剂 (inducer)
8、: 别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷） The Lac Operon: When Glucose Is Present But Not Lactose Repressor Promoter LacY LacA LacZ Operator CAP Binding RNA Pol. Repressor Repressor Repressor mRNA Hey man, Im constitutive Come on, let me through No way! CAP The Lac Operon: When Lactose Is Present But Not Glucose Re
9、pressor Promoter LacY LacA LacZ Operator CAP Binding Repressor Repressor mRNA Hey man, Im constitutive Repressor Repressor X This lactose has bent me out of shape Yeah ! RNA Pol. RNA Pol. 乳糖操纵子的调控机理 乳糖操纵子诱导物 别乳糖(allolactose)是诱导物 为什么选用 IPTG作诱导物？ 能 诱导酶的合成 ，但又 不被分解 的分子 ,称为安慰诱导物（ gratuitous inducer）。 由于
10、乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 X-gal（ 5-溴 -4-录 -3-吲哚 -半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被 半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。 IPTG和 X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。 为什么选用 IPTG作诱导物？ 某些诱导物与自然的 -半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如异丙基 -D-硫代半乳糖苷，（ isopropylthiogalactoside,IPTG）。 不被细菌分解性质稳定， 它的浓度在实验中不会改变。 复杂的动力学问题，便于研究。
11、 IPTG能在缺乏 lacY基因下而有效地被运送。 为什么选用 IPTG作诱导物？ 乳糖（葡萄糖 -1， 4-D-半乳糖苷） 半乳糖苷键中用 硫 代替了 氧 ，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同， IPTG虽不为 -半乳糖苷酶所识别，但它是 lac基因簇十分有效的诱导物。 乳糖操纵子的 CAP正调控 （ Positive Control of CAP） CAP(catabolite activator protein) -分解代谢基因激活蛋白 又称为 CRP (cAMP receptor protein), lac operon高水平转录 必需 的一个 激活蛋
12、白 。 CAP(同二聚体 ),含 DNA结合区 以二聚体的方式与特定的 DNA序列结合 cAMP结合区 与 cAMP特异结合，并发生空间构象的变化 ,形成 cAMP-CAP复合物（有活性 ） 乳糖操纵子的 CAP正调控 （ Positive Control of CAP） 当 CAP与 CAP结合位点这段序列结合时，可激活 RNA转录酶活性，使之提高 50X 葡萄糖 降解产物 ATP cAMP 5AMP CRP（非活性状态） CAP（活性状态） 乳糖操纵子的 CAP正调控 （ Positive Control of CAP） + + + + 转录 无葡萄糖， cAMP浓度高时 促进转录 有葡萄
13、糖， cAMP浓度低时 不促进转录 CAP Z Y A O P DNA CAP CAP CAP CAP CAP 乳糖操纵子的 CAP正调控 （ Positive Control of CAP） 葡萄糖效应 ：当细菌在含有葡萄糖套和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖。只有当葡萄糖消耗完，经过一段停滞期，在乳糖的诱导下半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖。 葡萄糖的 降解物 能 抑制腺苷酸环化酶活性 ，并活化磷酸二脂酶，因而降低 cAMP的浓度。 所以葡萄糖存在时， cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时 , cAMP浓度增高， CAP-cAMP 复合物形成（结合于 lac operon
14、CAP结合位点 )，才会促进转录。 乳糖操纵子的 协调 调控 (coordinate regulation) 由于 Plac是 弱启动子 ，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使 lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有 CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。 关键条件 ： lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。 Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控 The Lac Operon: When Lactose Is Present But Not Glucose Repressor Promoter LacY LacA LacZ Op
15、erator CAP Binding Repressor Repressor mRNA Hey man, Im constitutive CAP cAMP Repressor Repressor X This lactose has bent me out of shape CAP cAMP CAP cAMP Bind to me Polymerase Yeah ! RNA Pol. RNA Pol. The Lac Operon: When Neither Lactose Nor Glucose Is Present Repressor Promoter LacY LacA LacZ Operator CAP Binding CAP cAMP CAP cAMP CAP cAMP Bind to me Polymeras
