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1、1中医证候的基因芯片研究近况【摘要】 用现代科学技术研究中医证候是中医研究的重要课题。文章简要介绍了用基因芯片探讨中医证候本质的研究近况，主要包括肾阳虚证、虚寒证、心阳虚证、肺虚证、脾虚证和寒热证差异基因表达谱的研究，从而为从基因水平上阐释中医证候的本质特征和进一步建立中医证候的基因组学做了有意义的探索。 【关键词】 中医证候 基因芯片 生命科学近年生命科学最热门的三大领域是基因组研究、细胞凋亡和细胞信号转导。相应地也有三大生物技术给予支持，这就是 DNA测序、PCR 技术和生物芯片技术。自 1991 年美国加州旧金山Affymetrix 公司创造了世界上第一块 DNA 芯片、1995 年St
2、anford 大学发表第一篇基因表达芯片文章以来，基因芯片技术已广泛地被用于基因功能的研究1 。基因芯片是生物芯片中应用最广泛、技术最成熟的分支，又叫 DNA 芯片、DNA 微阵列，其是在面积不大的基片表面上以点阵的方式有序排列一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子（DNA 和 RNA 片段） ，并以此作为探针，在一定条件下与样品待测的靶基因片段进行结合或反应，反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪扫描记录，通过计算机软件分析，综合可读信息，最终实现对靶基因的2存在、含量及变异等信息的快速检测。1 中医证候及其证候基因组辨证论治是中医学理论的特点之一，论治取决于辨证。中
3、医的“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质反映。 “候”的原意则是用以说明事物变化的情状，即所谓的疾病的临床表现。由于中医学对于疾病的认识侧重于整体、宏观、司外揣内，重视疾病某阶段机体的整体状态，辨证论治也即是通过对疾病表现在外的征象，进而推测演绎疾病的病因、病性和病位，由此归纳出证的概念2 。 用现代科技研究中医“证候”是中医研究的重要课题，证候病机及其与疾病和方剂的相关性是证候研究的重要科学问题3 。中医证候是中医药研究的核心， “证候”本质的研究是中医现代化研究的热点和难点，如能获得突破性进展，必将使中医理论研究取得质的飞跃。应用现代医学理论和分子生物学技术阐明中医“证候”本质是实
4、现中医药现代化的基础和关键，具有重大科学意义。中医“证候”本质研究虽经历几十年至今未能实质性突破，其根本原因在于以前没有一种像基因芯片那样十分有效地研究手段能同时检测许多机体、组织和细胞的变化，并比较变化以识别其规律4 。中医证候的现代研究从以症状、疾病、组织、细胞等为主体，逐渐发展至分子水平、基因水平，并已由单个基因向多基因，由个别基因向基因组发展，由个别基因研究积累到研究基因表达谱，当今在引3入基因芯片技术后，建立起证候的功能基因组表达谱5 ，旨在寻找一些与证候相关的基因，然后根据这些基因与证候的关系密切程度用于证候的基因诊断和疗效评价6 。从中医理论看，证候的形成是由先天的体质因素和后天
5、的环境因素共同作用的结果，因而对证候的研究可能要绘制 3 张图谱：基因组图谱、单核苷多态性（SNP）图谱和蛋白质组学图谱。而 SNP 谱体现了不同人种和同一人种不同个体之间的基因组差异，并决定人类个体体质差异和疾病易感性，也可能是中医禀赋学说的基因组背景。2 中医证候的基因芯片研究2.1 肾阳虚证倪红梅等7对肾阳虚体质青少年差异表达基因的基因芯片研究，选取上海 1624 岁青少年 154 例进行肾阳虚体质筛查，筛查出 6 例肾阳虚体质者，男性 1 例，女性 5 例，余 148 例为对照，分别采集两组的外周血，分离白细胞并抽提 RNA。基因芯片采用上海博星公司的 H80S 型，可做人标本的 8
6、465 点杂交,结果筛选出127 条差异基因，其中 63 条上调基因，64 条下调基因，其涉及免疫相关、细胞周期蛋白、发育相关、细胞生长、细胞凋亡相关蛋白、代谢、离子通道、转运蛋白、转录因子，以及信号转导系统。由此说明体质的本质是人体防御免疫功能、自我代偿修复和自我调节的4反映，其物质基础是建立在人体各系统形态、机能及代谢活动之上的，其内在机理也是多系统多环节的。谭从娥等8对筛选出 1例骨关节炎（OA）肾阳虚证行温针治疗（取穴：气海、关元、足三里、内外膝眼、阳陵泉） ，于治疗前后采集其外周血，做白细胞RNA 抽提，以基因芯片研究其治疗前后的基因表达谱。结果：在70 条差异表达基因中，上调基因
7、49 条，下调基因 21 条，并对 34条基因初步分类分析：与免疫相关基因 10 条，主要表现为上调。如退火素 A1 基因（NM-000700 ） ，OA 早期一些患者滑膜液中可有 T 细胞浸润，OA 晚期某些细胞因子（IL-1,TNF- ）参与局部组织损伤，其与炎症免疫和自身免疫发生有关，致使关节软骨发生退行性变，故认为温针治疗后，免疫相关基因上调，提示温针治疗后可通过调节机体的免疫反应来干预 OA 的发病过程,还有热休克90KD 链蛋白 1 基因（NM-007355）与基础代谢相关的基因 5 条, 如II 型 cAMP 依赖性调节蛋白酶 链基因(NM-002736),经针刺后上调了 2.4
8、3 倍,已知 cAMP 为调节新陈代谢的第二信使，其受 cAMP依赖性蛋白激酶(PKA) 调节，可诱导蛋白质酶，加速新陈代谢，升高体温，调节机体能量平衡。提示温针可调节与基础代谢相关基因表达来改善患者基础代谢低的临床症状。与肌肉运动相关的基因 5 条,主要为下调基因,如胆碱能受体、烟碱性、 多肽 1 基因（NM-000079） ，此基因是突触内神经信息传递的基础，与骨骼肌运动、肌肉收缩直接相关。与生长发育相关基因 9 条，人体各组织均有转化生长因子 （TGF ）诱导早期生长反应基因（ NM-005655） ，上5调了 2.8 倍，其可调节细胞生长分化。与信息相关的基因 5 条，主要表现为下调，
9、如 G 蛋白信号调节因子 1（RGS1）基因（NM-002922）下调了 0.35 倍，其是 G 蛋白结合受体复合物的重要调节和组成部分。温针可促进气血流通，使机体协调，起到全身调节作用。杨丽萍等9也以温针治疗肾阳虚骨关节炎,筛选出与免疫相关基因,其中上调基因 5 条,下调基因 4 条,上调基因主要有 NCF1 基因和 CCR7 基因, 前者编码嗜中性细胞因子,后者编码 G 蛋白受体家族成员-趋化因子受体 7。温针治疗下调基因 CD97,其编码一个EGF-TM7 家族成员,并存在于大部分活化的白细胞表面的糖蛋白, 有 G 蛋白偶联特征。陈晓玲等10对一个典型的肾阳虚家系 15个成员,以寡核苷酸
10、杂交技术对其外周血单核细胞的差异表达谱分析研究, 同时对血样本进行血液生化、免疫指标检测,还设正常人 10 人作为对照,比较二者结果。尽管存在普遍的血液生化与免疫学指标异常, 但该肾阳虚寒证家族患者作为一个典型的阳虚寒证抽样,经统计学处理均未见显著性差异。此提示检测众多血液生化、免疫指标,对整体性失调的证侯群,其临床意义不大, 故作为西医临床诊断所依仗的血液生化与免疫学指标,在诸如肾阳虚寒证等中医证的诊断方面,参考意义不明显。用 5 张北京博奥生物芯片中心生产的人全基因组表达谱芯片(2 200 个杂交点), 来研究肾阳虚患者外周血红细胞基因表达谱,结果: 典型肾阳虚证/正常对照组:上调基因 1
11、00 条,下调基因 33 条;肾阳虚证/正常对照组:上调基因 148 条,下调基因 31 条;典型肾阳虚证治疗显效者治疗前/治疗后:上调基因 12 条,下调基因 47 条;6典型肾阳虚证/正常配偶:上调基因 66 条, 下调基因 44 条。这些基因主要为：物质代谢、信号转导、能量代谢和免疫调节等,初步反映出肾阳虚证患者恶寒喜暖、肢冷倦卧、面色白等宏观证候在微观基因表达的分子生物学基础。2.2 虚寒证为了研究虚寒证与能量代谢的关系，陆明等11 分别在四川和陕西选择临床较常见的虚寒证肢冷患者 10 例和 4 例，前者温针治疗（取穴同谭从娥等8 ）14 d 后，与对照组比较及治疗前后自身比较，结果在
12、 4 张芯片中患者 1，2，3，4 的差异表达基因分别为 41 条、246 条、57 条和 70 条。后者以有明显肢冷者为实验组，无肢冷者为对照组，比较二者，结果差异表达基因 101 条。在5 张芯片中，共有重复差异表达基因 30 条，可查库基因 19 条，其中与能量代谢相关基因占 21.43%，说明肢冷与新陈代谢密切相关。吴斌等12对一虚寒证典型家系（3 代 16 人）筛选出虚寒证患者 5 人作为实验组，正常人 5 人做对照组，采集其外周血，抽提其细胞 RNA 行基因芯片检测，芯片采用上海博星公司的 BiostarH-40S cDNA 表达谱芯片。结果：筛选出差异基因 79 条，主要有与新陈
13、代谢有关的基因占 56.04，与细胞生理过程有关的占40.66，与细胞信号转导有关的占 29.67%,与生物的生理过程有关的占 15.38%,表明虚寒证集中于代谢基因的异常表达。另外，还涉7及 15 条路径：其中人脂蛋白酶 mRNA(Hs.180878)明显低表达，其主要功能为水解循环乳糜微粒的三酰甘油和极低密度脂蛋白，涉及了脂肪代谢路径。为研究 OA 虚寒证的基因表达谱，选择患者 8例，同时选 8 例正常人为对照，采血提取细胞 mRNA 以北京博奥公司的 22000 点基因芯片检测,结果筛选出差异表达基因 75 条,其中上调基因 23 条,下调基因 52 条13 。研究发现与免疫相关基因 7
14、条如与严重 OA 的自身免疫机制密切相关的中性粒细胞因子 1 基因（NM-000265） ，可促使免疫细胞穿过外周组织并进入次级淋巴器官的趋化因子受体 7 基因（ NM-001838） ，与免疫抑制相关的环孢素 B 受体基因（NM-000942）等。还有调节软骨细胞生长分化的生长因子相关基因 4，如转化生长因子 、胰岛素样生长因子等，其参与细胞的有丝分裂，促进软骨细胞增殖、分化和合成软骨基质。如调节细胞生长和分化的早期关键生长反应因子 3 基因（NM-004430） ，激活转化生长因子（TGF-1）的早期生长反应因子 1 基因（NM-001964）,具有抑制表皮生长因子受体并在其溶酶体降解中具
15、有重要作用的选择性连接蛋白（NM-003100）等。还有 Ras诱导衰老因子基因（AF438313）上调。与能量代谢低下相关基因5 条，如构成线粒体、呼吸链结构的线粒体 ATP 合成酶运输 H的F1 复合体亚家族基因（NM-001697）GTP 酶激活蛋白的 G 蛋白信号调节因子 2 基因（NM-002923）等。由肾主骨、藏精气、主生长发育，故 OA 发病与肾虚有密切关系，而肾虚时亦可出现一系列生长发育相关基因表达异常。王米渠等14对寒证基因芯片的检8测数据提出了分析方法：纵向发展的聚类分析（个体用药后的连续追踪，进而研究家系寒证） ；横向互比的聚类分析（利用树状分层图等分析有关证候的调查数
16、据） ；分证候的聚类分析（如肢冷单个证候的疗效分析） ；合寒证聚类分析（研究寒证证候变异主因素及其主效基因组之关系） 。杨丽萍等15也对上述家系进一步做了能量代谢相关基因异常表达的探讨，结果涉及新陈代谢基因达70.73。2.3 心阳虚证用基因芯片探讨冠心病心阳虚证特征性基因表达谱，各采集5 例患者和正常人外周血，抽提白细胞 RNA 行基因芯片检测，并对5 例患者做温阳通痹治疗，1 例显效，比较这 1 例治疗前后差异基因表达。结果：5 例患者与正常人比较，差异表达基因 231 条，其与典型患者（1 例）治疗前后的基因芯片差异基因谱中有 39 条差异基因表达一致，两条差异基因表达相异。说明这 39 条基因的差异表达可能是冠心病心阳虚证发生的分子生物学基础。差异基因的功能分析表明：主要涉及代谢、细胞发育、分化相关和免疫应答相关基因，部分阐释了冠心病心阳虚证的病理机制16 。2.4 肺虚证对慢性阻塞性肺疾病
