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1、。了解基因转录调控的关键是识别蛋白质与 DNA 的相互作用 , ChIP 是全基因组范围内ChIP-chip 技术在肿瘤研究中的应用进展#朱新江，戴冬秋*（中国医科大学附属四院胃肠外科，沈阳）510摘要：肿瘤的发生、发展是一个复杂的连续过程, 众多基因或蛋白表达产物在不同时段异常表达以及它们之间构成的复杂调控网络使得肿瘤的生物学行为至今仍未得以阐明。生物芯片是后基因组时代肿瘤学研究中的重要手段，其中 Chip 技术与芯片技术相结合( ChIP-chip)的出现，成为研究一些关键组分活性的有力武器, 广泛用于肿瘤细胞的表遗传修饰、DNA-蛋白结合位点的研究。通过结合位点分析信息与基因表达数据相联
2、系, 将有助于寻找生物标志物, 研究疾病的分子病理学等, 从而了解基因表达的机制, 找到调控基因表达的方法, 研制出有效的治疗手段。本文重点对 ChIP-chip 技术在肿瘤研究和诊断治疗中的应用做一简要综述。关键词：ChIP-chip；肿瘤；基因表达；表遗传学15 Advances of ChIP-chip in cancer researchZHU Xinjiang, DAI Dongqiu(Department of Gastrointestinal Surgery,the Fourth Affiliated Hospital,China Medical University,Sheny
3、ang 110032)Abstract: The development of cancer is a process of complex and consecutive changes, Many202530abnormal gene or the product of protein expression in different times and tumor biologicalbehavior has yet to be elucidated. Biochip is an important technique in the post genome era foroncology
4、research, The Chip technology and the combination of chip technology (Chip - chip),become the powerful weapon of the some of the key components of activity, Chip-chip had widelyused in the field of the tumor cells epigenetic modification and DNA - protein binding site.Through the analysis of the bin
5、ding site information associated with gene expression data,whichwill help to find biomarkers, research on molecular pathology of the disease,and so on. Tounderstanding the mechanisms of gene expression, finding a way to regulate gene expression,developing effective treatments . This article focus on
6、 ChIPchip technologies in cancer researchand to make a brief review on the application of the diagnosis and treatment.Keywords: ChIP-chip; cancer; gene; Epigenetics生命科学领域新问题的出现不断推进新技术的产生和发展, 特别是在后基因组时代, 基因组学的研究热点已转向基因功能。真核生物基因组 DNA 以染色质形式存在,研究蛋白质与DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。基因组35 DNA 的甲基化、组
7、蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰 , 核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性, 哺乳动物转录调控序列分散在较大区域, 组蛋白修饰状态达 100 多种,这些因素都增加了转录调控的复杂性 1识别 DNA 与蛋白质体内相互作用的标准方法 2, 最初用于组蛋白修饰研究3,后来用于转录40 因子4。 ChIP 与芯片(Chip,microarray) 或测序(Sequencing) 相结合的 ChIP-chip 和 ChIP-Seq 技术是在全基因组水平分析 DNA 与蛋白质相互作用的两大主要技术。本综述将介绍 ChIP、ChIP-chip 的技术特
8、点、发展趋势及在肿瘤研究中的应用进展。基金项目：Higher Specialized Research Fund for Doctoral Program of Ministryof Education of China(#20102104110001).作者简介：朱新江，（1975-），男，主治医师，胃癌的表遗传学研究。通信联系人：戴冬秋，（1963-），男，教授，胃癌的表遗传学研究。-1-1 ChIP 技术ChIP 技术由 Orlando 等5于 1997 年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞45 用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段; 然后用特异性抗体免疫
9、沉淀目标蛋白与 DNA 交联的复合物 , 对特定靶蛋白与 DNA 片段进行富集。采用低 pH 值条件反交联, DNA 与蛋白质之间的 Schiff 键水解, 释放 DNA 片段。通过对目标片段的纯化与检测, 获得 DNA 与蛋白质相互作用的序列信息。在上述 ChIP 过程中,甲醛能够进入细胞并使蛋白质与 DNA 或蛋白质与蛋白质之间通过希弗 (Scihff)键交联,形成稳定结合的复合物。如50556065果交联效果不太好 ,可以先用交联剂 DMA(Dimethyl adipimidate) 或 DSG(Disuccnimidylglutarate)处理细胞 ,以加强后续甲醛交联的效果。破碎 D
10、NA 可采用超声物理破碎或特定酶切消化,以获得所需长度的 DNA 片段。由于 DNA 片段长度将影响抗体免疫沉淀效率 ,因此破碎DNA 是 ChIP 实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关6。ChIP 技术是研究表遗传学中 DNA 甲基化与组蛋白修饰最经典的方法之一，染色质免疫沉淀技术犹如摄相机，可以捕捉到在染色质水平上基因表达调控的瞬时事件，从而反映体内基因表达调控的真实情况，被广泛用于研究体内染色质组蛋白修饰在基因表达中的作用。可以灵敏地检测目标蛋白与特异 DNA 片段的结合情况，并已成为研究染色质水平基因表达调控的最有效的方法7。当前 ChIP
11、 技术主要应用于以下几个方面 : ( 1) 组蛋白修饰的研究;( 2) 转录调控的分析; ( 3) 药物开发的研究 ; ( 4) 有丝分裂的研究。组蛋白的修饰是通过细胞的有丝分裂来维持, 而表遗传学稳定的遗传状态是通过有丝分裂来提供细胞分化和器官发育的基础8。如果基因遗传特征也能影响染色质变异,则可以在组蛋白修饰研究中运用等位基因特异性的染色质免疫共沉淀来分析染色质的变异 9。DNA 的甲基化和组蛋白的修饰在基因表达上或许产生协同或拮抗的作用, 运用 ChIP 分析技术可探究 DNA 甲基化和组蛋白修饰之间的关系。ChIP 对检测结合有 DNA 的蛋白的表达非常有效, 这些蛋白或许可调控染色质
12、结构以及与 DNA 相联系的特异 DNA 区域。但是,由于使用染色质免疫沉淀技术得到的结果是大量而又复杂的，因此运用普通方法对其结果的分析和处理就显得力不从心。近年来发展起来的基因芯片与染色质免疫沉淀技术相结合的方法大大促进了在基因组水平上高通量对 DNA 和蛋白质的相互作用的研究。70 22.1ChIP-chip 技术ChIP-chip 的基本原理及分类ChIP-chip 是将生物芯片平台与 ChIP 实验相结合在全基因组或基因组较大区域上高通量分析 DNA 结合位点或组蛋白修饰位点的方法。 ChIP-chip 获得的信息量主要取决于芯片表面固定的探针数量、探针的密度、分辨率与覆盖度。探针密
13、度指生物芯片表面所固定的75 DNA 探针的数量。分辨率指设计生物芯片时两个相邻探针的 DNA 序列在基因组上相隔的距离, 分辨率越高, 相邻探针之间的距离越短。覆盖度指固定在生物芯片上 DNA 序列占基因组全序列的比例。 最理想的芯片是能够覆盖全基因组, 但是由于人的基因组巨大, 尚不可能在一个芯片上固定覆盖人类全基因组所有的探针。芯片制作方法主要有两种: 一种是将合成的寡核苷酸点到芯片上。点样方法的优点是制作方便, 但存在可能由于点样针头80 洗涤不彻底而造成交叉污染及样点不均一等问题;另一种是原位合成法, 即寡核苷酸探针在芯片上原位“生长” , 如 Affimetrix 的“光蚀刻原位合
14、成技术”, Nimblegen 公司的“无掩-2-续的研究还发现了调控细胞周期的转录因子 SBF 和 MBF12 与传统的 ChIP-PCR 相比较，膜芯片合成技术(Maskless array synthesis)” 。原位合成法具有较好的重复性和较高的密度。芯片杂交所需样品量较大, 要对免疫沉淀后的 DNA 进行 PCR 扩增以达到杂交要求。常用的扩增方法是 LM-PCR(Ligation-mediated PCR), 将反交联并纯化过的 DNA 用 DNA 聚合酶补859095平后再连接通用接头(Linker),然后用与通用接头互补的引物进行扩增, 在扩增过程中引入荧光基团。由于免疫沉淀
15、后的 DNA 片段长度不同, 每种长度片段的百分比含量不同 , PCR 的扩增效率不同。对于中等片段 DNA 这种方法能够进行等比例扩增 ,但对于较长片段的 DNA扩增效率将降低。一般通过控制 PCR 循环数, 以减少扩增产生的偏向性(Bias)。芯片杂交检测可用双色竞争法，ChIP 获得的 DNA 与对照(Control)DNA 分别用不同颜色标记并竞争性与芯片杂交,根据信号强弱判断哪些位点是免疫沉淀富集的位点。 对照 DNA 通常来自超声破碎后不加特异抗体直接保留下的 DNA 或与特异抗体同物种的 IgG 免疫沉淀的 DNA为对照。如果采用单色杂交检测,则需要分别检测染色质免疫沉淀 DNA
16、 与对照 DNA 芯片杂交的结果。目前，ChIP-chip 是全基因组范围内分析转录因子或其它染色质蛋白结合位点及表观遗传机制的两大主要技术。随着芯片技术的发展,现有各种商业化芯片可以选择,如不同物种的启动子芯片、CpG 岛芯片、叠瓦芯片(Tilling array)等, 也可以根据具体研究需要定制芯片10。全基因组叠瓦芯片是按照一定的分辨率和探针长度设计的信息量较大的芯片，如 Nimblegen公司提供的分辨率为 100 bp、探针长度为 50 bp 的代表人类基因组的全套芯片共有 38 张。从而可以为疾病研究、新药开发领域提供独特的芯片方案。100 2.2 ChIP-chip 技术的发展2000 年 Rene 首先利用 ChIP-chip 技术在酵母中发现新的转录因子 Gal4 和 Ste1211，后，13ChIP-chip 技术是全基因组的“基因倒序” 方法。ChIP-chip 技术的另一大优势在于它能分辨出与蛋白因子与基因的关系是直接的还是间接的
