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4、I03 1DRFPA量蟊二芒曼幂U昌-昌喜蟊二苎虽昌U昌P昌RFPNSFl 52D2蕊 麟囊孽甲嘲=RFP ARFPNSFl B2D1 6融 pZ RFPA量舌莹器量帚善蟊主量车墨Uc003墨幂图29 NSFl62滴度测定结果RFPNSFl 62D4遂 眇黔j 雾滋寥、叠RFFRFPNSFl 62D32簌 P?、0。 1DRFPAFig29 The titer result of NSFl62依据假病毒感染的阳性率，计算出感染细胞数，获得假病毒的滴度值(图210)。Z I I I I l l I l I旧卜装oNI摹。一I装oNI装o【I装ocH装oN一摹oq_装o一装oc一装oN一摹oc一装
5、。乜【装o【装ocN装。价I摹ooc摹ocN摹oo“摹。冀N装oo式摹otN摹。寸“摹oqN摹。叼N摹o“装。甙H装。寸N装。心N摹o_【摹oo寻装。寸N摹o崎摹。寸寸。小oc装。寸N装。冀n装oN“装oo“摹oN装o【寸装on装oN寻装oo“装。峙“摹o”9装oo8摹oo“摹o=摹on6装。心8摹。一8摹。寸卜装oI1一摹on6摹oq卜摹on6摹oNI一心小。口一装o6摹oo6摹oIH摹ocoH装oc昏。小o寸No小o，心【摹oo9一装。乜nH摹onoH摹on0N装o8_嫡小。吼9_装oIN摹oo0N装。寸卜H装on8一装。冀岔_【摹oNcN摹。峙0n装。卜心H摹o1寸摹ooNno小oNN摹
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7、N懈武料赳，区窖厶昆嚣辑韬嫣旺g螅咏懈婴警蜷心H嚣求岬咪姆结果与分析RFP报告基因系统和GFP报告基因系统具有极其相似的特点，但是RFP在表达后，有一个成熟的过程，大概需要一天左右，然后才能通过荧光显微镜观察到红色荧光，因此，RFP的检测时间较GFP增加了一天左右。两者可以用相同的仪器进行检测，方便了实验操作，同时又满足了实验的多样性需求。构建携带RFP报告基因的假病毒对于完善整个HIV-1假病毒系统在荧光蛋白检测系统中的应用具有重要意义，可以应对多样的实验需求。23 B一半乳糖苷酶报告系统lacZ基因可以表达B半乳糖苷酶(13-gal)蛋白，可以水解底物xgal，产生蓝色产物。目前国际上使用
8、的HIV-1感染性克隆，所使用的检测手段就是lacZ报告基因及Luc报告基因。通过构建携带有lacZ报告基因的克隆Bobi1acZ，应用于HIV-1假病毒系统，表达出携带有lacZ基因的假病毒，将其感染Tzmbl细胞后，4048小时即可检测病毒的感染情况。检测方法与HIV真病毒的检测方法一致，可以较为平行的对比真病毒和假病毒的生物学特性。采用与荧光蛋白相同的测定病毒的滴度的方法，将表达出来的HIV-1假病毒对倍稀释后感染Tzmbl细胞，4048小时后检测假病毒感染情况。具体方法为先将细胞上清吸掉，加入50ul孑L固定液，闭光固定5分钟后，吸掉固定液，用80ul孔PBS洗两遍，吸干PBS后加入显
9、色底物Xgal，37反应2小时后，吸掉显色液，拍干后读取数据。病毒感染细胞后，通过显色会在细胞上形成蓝色产物，直接使用Elispot即可对变蓝的细胞进行计数，即可知道感染的病毒量(图211)。58a均Ct篁Z薰赣黪黪辫臻静静静瓣蠢薹蚕枣。寸掣HN必圉墨釜够粤复。吣Q葺。眦IQ_Io盘出厶-!10二=l一，暑I一它。盘占。电暑Q啦盘量二u爵Q-oIo_一-oII一一一Nw一-!I越填艚倏晕一-AII摊蛊函醐躯辚厶J10靶鞲IIZ匝一蠹势onoZ爹黪孥蠹辫墨爱黪静辫努羹囊簿誉荤擀缀蠹蠹舞黪岭H峨Z轨刚Z帕寸汹Znon1躇Z豁求岬眯姆结果与分析观察显色结果，可以大致推断出表达的HIV-1假病毒的病毒
10、滴度，也可以通过计算获得具体的数据(图212)。O图212携带fl-gal报告基因的各HIV-1假病毒滴度Fig212 The titer of each HIV-1 pseudotyped virus with II-gal reporter gene2。4 Luo i foraso基因报告系统Luciferase(萤光素酶)是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali的萤火虫体内的萤光素酶。萤光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中。最早构建出来的HIV假病毒所携带的报告基因就是Luciferase。表达与生产携带有Luc报告
11、基因的HIV假病毒有两种方法。一种是国际上最早使用的两质粒法(详见前言)，但这种方法在本实验室的应用不多，主要是病毒产量较低。第二种方法就是本研究中采用的四质粒共转染的方法，病毒产量有较大提高，能够满足正常实验的需求。将表达的假病毒对倍稀释感染Tzmbl细胞，第一孔假病毒用量为50ul，48小时后去掉细胞上清，用100ul裂解液4。C作用20min。去60ul裂解上清与化学发光板上，加入Luc底物。通过化学发光仪来检测发光强度。以A亚型假病毒60结果与分析的NKA3605为例(图213)，可以发现，Luc发光检测存在较高的背景值，并且，只有当阳性值达到104以上时，才具有较好的区分度。因此，需
12、要对表达的假病毒进行较高倍数的浓缩，以获得较好的实验结果或数据。通过对假病毒滴度的测定，获得携带Luc报告基因的各个假病毒的滴度数据(表23)。牵害梦梦$S礴病毒用量 lue值50ul 1160525ul 4655125ul 3王60625ul 22253125ul 165515625ul 875O78ul 955明性 6图213NKA3605梯度稀释感染的Luc发光值Fig213 The Luc emission value of NKA3605 gradient dilution infectionLuc检测的本底较高，因此选择发光值在1000以上的作为阳性，1000以下的为阴性。以此为基
13、础计算携带Luc报告基因的假病毒的滴度。将表达的假病毒上清梯度稀释感染Tzmbl细胞，48小时后裂解细胞，取裂解液上清加入底物测定发光值。具体数据见表23。61结果与分析表23 HIV-1假病毒Luc发光值检测Table 23 The Luc emission value of HIV-lpseudovirus假病毒用量假病毒名称50ul 25ul 125u1 625ul 32ul 16ul 078ul 阴性NKA3605 1 1605 4655 3160 2225 1655 875 955 680NEB43 6650 3760 1 970 860 650 720 640 690NEB896
14、6840 3510 1650 860 590 630 610 630NSFl62 21325 15460 8950 4760 2850 1325 650 680NEB3074 9250 4670 2840 1 650 940 680 650 680NEBl069 7360 3890 1670 850 640 690 620 680NEC2424 7540 3290 1 820 1060 580 650 630 680NECMJ4 13650 7820 3670 1920 950 680 710 690NED94 8210 4260 2670 1350 640 680 710 660NKD400
15、3 15920 10420 6940 3480 2125 1250 780 720NEDC249 8640 4350 2670 1 580 740 655 690 640NEF3088 1 3280 8435 4860 2590 1460 860 690 640NEG3096 7650 3520 1 760 1 020 685 650 750 620NKD3 l 12 7760 3870 2260 1240 680 590 670 640NKH4005 10030 5215 2865 1590 780 840 790 740NEAE269 9460 5 160 3800 1670 880 650 630 6801 00000006000000OO图214 HIV-1假病毒Luc发光值检测Fig214 The Luc emission value of HIV-lpseudovirus62结果与分析取发光值在5000左右作为一个线性值用于计算假病毒的相应发光值滴度，获得16株
