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1、1 FSPYL030 饮料 金黄色葡萄球菌的检验 酶试验法 F_SP_ YL_ 030 饮料 金黄色葡萄球菌的检验 酶试验法 1 范围 本方法适用于饮料中 金黄色葡萄球菌的检验 。 2 原理 饮料样品处理后 ， 经增菌及分离 ， 采用血浆凝固酶试验判定结果并计数 。 3 试剂 3.1 胰酪胨大豆肉汤 3.1.1 成分 胰酪胨 (或胰蛋白胨 ) 17g 植物蛋白胨 (或大豆蛋白胨 ) 3g 氯化钠 100g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g 蒸馏水 1000mL 3.1.2 制法 将上述成分混合 ， 加热并轻轻搅拌至完全溶解 ， 分装后 ， 于 121 下高压灭菌 15min， 溶液的最终
2、 pH 为 7.3 0.2。 3.2 7.5%氯化钠肉汤 3.2.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 75g 蒸馏水 1000mL 3.2.2 制法 将上述成分加热溶解 ， 校正 pH 为 7.4， 分装试管 ， 于 121 下高压灭菌 15min。 3.3 血琼脂平板 3.3.1 成分 pH 7.4 7.6 豆粉琼脂 100mL 脱纤维羊血 (或兔血 ) 5 10mL 3.3.2 制法 加热溶化琼脂 ， 冷至 50 ， 以灭菌手续加入脱纤维羊血 ， 混匀 ， 倾注平板 。 亦可分装灭菌试管 ， 置成斜面 。 亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂 。 3.4 Baird-Par
3、ker 琼脂平板 3.4.1 成分 胰蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 酵母膏 1g 丙酮酸钠 10g 甘氨酸 12g 氯化锂 (LiCl 6H2O) 5g 琼脂 20g 蒸馏水 950mL 2 3.4.2 增菌剂的配法 30%卵黄盐水 50mL 与除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10mL 混合 ， 保存于冰箱内 。 3.4.3 制法 将各成分加到蒸馏水中 ， 加热煮沸至完全溶解 。 冷至 25 ， 校正 pH 为 7.5。 分装每瓶95mL， 于 121 下高压灭菌 15min。 临用时加热溶化琼脂 ， 冷至 50 ， 每 95mL 加入预热至50 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL， 混匀后倾注平板
4、。 培养基应是致密不透明的 。 使用前在冰箱储存不得超过 48h。 3.5 肉浸液肉汤 3.5.1 成分 绞碎牛肉 500g 氯化钠 5g 蛋白胨 10g 磷酸氢二钾 2g 蒸馏水 1 000mL 3.5.2 制法 将绞碎之去筋膜无油脂牛肉 500g 加蒸馏水 1000mL， 混合后放冰箱过夜 ， 除去液面之浮油 ， 隔水煮沸半小时 ， 使肉渣完全凝结成块 ， 用绒布过滤 ， 并挤压收集全部滤液 ， 加水补足原量 。 加入蛋白胨 、 氯化钠和磷酸盐 ， 溶解后校正 pH 为 7.4 7.6 煮沸并过滤 ， 分装烧瓶 ，于 121 下高压灭菌 30min。 3.6 灭菌盐水 3.7 兔血浆 3.
5、7.1 成分 柠檬酸钠 3.8g 蒸馏水 100mL 兔血 全血 3.7.2 制法 取柠檬酸钠 3.8g， 加蒸馏水到 100mL， 溶解后过滤 ， 装瓶 ， 121 高压灭菌 15min。 取3.8%柠檬酸钠溶液一份加兔全血四份 ， 混好静置之 ， 则血球下降 ， 即可得血浆进行试验 。 4 设备和材料 4.1 显微镜 4.2 恒温箱 ， 36 1 4.3 离心机 4.4 灭菌吸管 ， 1 mL、 10 mL 4.5 灭菌试管 4.6 灭菌平皿 4.7 均质器 4.8 载玻片 4.9 L型涂布棒 4.10 酒精灯 4.11 接种环 5 操作步骤 5.1 增菌培养法 5.1.1 检样处理 固体
6、样品称取 25 g； 液体样品吸取 25 mL， 加入 225 mL灭菌生理盐水 ， 混匀 。 5.1.2 增菌及分离培养 吸取 5 mL上述混悬液 ， 接种于 7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤 50 mL培养基内 ， 置 363 1 温箱培养 24h， 转种血平板和 Baird-Parker平板 ， 36 1 培养 24 h， 挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验 。 5.1.3 形态 本菌为革兰氏阳性球菌 ， 排列是葡萄球状 ， 无芽胞 ， 无荚膜 ， 致病性葡萄球菌菌体较小 ，直径约为 0.5 1m。 5.1.4 在肉汤中呈混浊生长 ， 在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄
7、清 ， 菌量多时呈混浊生长 ， 血平板上菌落呈金黄色 ， 也有时为白色 ， 大而突起 、 圆形 、 不透明 、 表面光滑 ， 周围有溶血圈 。在 Baird-Parker平板上为圆形 、 光滑凸起 、 湿润 、 直径为 2 3 mm， 颜色呈灰色到黑色 ， 边缘为淡色 ， 周围为一混浊带 ， 在其外层有一透明圈 。 用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度 ，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 ； 但无混浊带及透明圈 。 5.1.5 血浆凝固酶试 验 吸取 1： 4新鲜兔血浆 0.5 mL， 放入小试管中 ， 再加入培养 24 h的金黄色葡萄球菌浸液肉汤培养物 0.5 mL， 振荡摇匀 ， 放 36 1
8、 温箱或水浴内 ， 每半小时观察一次 ， 观察 6 h， 如呈现凝固 ， 即将试管倾斜或倒置时 ， 呈现凝块者 ， 被认为阳性结果 。 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照 。 5.2 直接计数方法 5.2.1 吸取上述 1： 10混悬液 ， 进行十倍递次稀释 ， 根据样品污染情况 ， 选择不同浓度的稀释液 1 mL， 分别加入三块 Baird-Parker平板 ， 每个平板接种量分别为 0.3 mL、 0.3 mL、 0.4 mL，然后用灭菌 L棒涂布整个平板 。 如水分不多吸收 ， 可将平板放在 36 1 温箱 1 h， 等水分蒸发后反转平皿置 36 1 温箱培养 。 5.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落 ， 并从中任选 5个菌落 ， 分别接种血平板 ，36 1 24 h培养后进行染色镜检 、 血浆凝固酶试验 ， 步骤同增菌培养法 。 5.2.3 菌落计数 ： 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加 ， 乘以血浆凝固酶阳性数 ， 除以 5， 再乘以稀释倍数 ， 即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数 。 6 参考文献 GB 4789.10 1994 “ 食品 卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 ” 。
