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1、 SEPARATION SCIENCE REDEFINED 2005 年 5 月 31 由 HPLC到 UPLC的试验传输提高分析吞吐量 典型的HPLC 试验经过传输和优化，用于沃特世的ACQUITY UPLCTM系统，以获得更高的样品分析吞吐量和更好的试验灵敏度。加速未来方法传输的策略已经形成。运营成本分析及试样处理量证明了UPLC相对于HPLC 的成本优势。 Ying Yang 和 Craig C. Hodges 艾利斯达分子传输公司（Alexza Molecular Delivery Corporation），Palo Alto ，加州 94303 ，电子邮件：对较大制药分析吞吐量的需求
2、的不断增加，促成了Waters ACQUITY Ultra Performance LC (UPLCTM)的诞生。该系统可以通过使用一种全新的细粒分离材料（1.7 微米）和独特的化学性质来提供更快速的分析。 为了实现该物质的快速分离，色谱柱硬件及仪器的设计均在典型的HPLC 基础上做了重大改进。UPLC 的工作压力较高（可高达15,000 psi），将试样注入一个较小的系统间隙体积内，并以高数据率捕获检测器信号，以获得快速洗脱峰。一种全新的针型设计可根本减少有助于降低定量限（LOQ）的残留物。 在本项目中，用于质量控制（QC ）的 HPLC 法经过优化以适应UPLC。考虑了减少总体运行时间、降
3、低单位试验成本和增加仪器运行时间的策略。 方法开发 原来的 10 分钟 HPLC QC 试验方法的制订是为了量化有机溶剂抽出物中杂环药物（Cpd A ）的含量。通过一种内部标准（IS ）来补偿样品制备损失，还需要有一个终端洗涤坡来消除后期洗脱干扰。 最初的 HPLC 试验到 UPLC 的传输只是通过将一个比例因素应用于流动相流速和试样进样体积来完成的。该比例因素通过色谱柱横截面积的比值得出，以便保持流动相线性速度。 通过 UPLC 法得到的色谱波峰十分狭窄，分离度过大，表明有机会对方法进行改进。流动相流速上升，直到受到色谱柱反压力的限制。但是，后来进行的色谱柱使用寿命研究表明，通过增加有机溶剂
4、含量来减少总体运行时间更为经济。溶剂的用量也显著下降。图 1中的色谱将最初的 HPLC 法与初始规模和最终 UPLC 条件的进行比较。HPLC 和最终 UPLC 方法的参数列于表 1。 方法优化指南与观察结果 在优化 UPLC 方法的过程中，考虑到了加速日后方法传输的问题，并给出以下建议： 增加洗脱溶剂的强度，以减少运行时间，利用 UPLC 色谱柱的高分辨率潜力（参见表 II）。 在增加溶剂强度的基础上增加流动相流速，以延长色谱使用寿命。当高分辨率的高流动相线性速度可以达到时（见图 2），与任何色谱一样，以最大额定压力的 80%进行的日常运行会缩短使用寿命。根据我们的经验，UPLC 按 800
5、0 psi 左右或更低的速度运行，每次试验的成本比 HPLC 显著降低。保持尽可能低的流速同样可以降低溶剂及废物处理成本，尽管这些已经比 HPLC 少了一个数量级。 32 SEPARATION SCIENCE REDEFINED 2005 年 5 月 图 1： 色谱（由顶至底）：原始 HPLC，至 UPLC 的初始规模显示波峰波形改善及进一步方法优化的可能性，及最终的 UPLC 方法。洗脱峰的顺序：内部标准（IS ），然后是 Cpd A。 通过利用低系统间隙体积来减少色谱重平衡次数。流动相中程式化的变化耗时到达色谱柱。小 UPLC 间隙体积 （110 微升，是 HPLC 的间隙体积的 15%
6、）允许部分简化原试验。色谱柱重平衡在 UPLC 中下一次样品加载过程中完成，进一步增加吞吐量。 表 I：原 HPLC 对优化后 UPLC 的试验参数 HPLC 试验 UPLC 试验 色谱柱 XTerra C18，50 X 4.6毫米，4 微米颗粒 ACQUITY UPLC BEH C18， 50 X 2.1 毫米，1.7 微米颗粒 流速 3.0 毫升/ 分钟 0.6 毫升/ 分钟 洗针 甲醇 强洗针： 200 微升甲醇；弱洗针： 600 微升 CAN ：H2O 10:90 进样体积 20 微升 3 微升部分循环充注或 5 微升全循环充注带自动充满 梯度 (时间单位分钟) (ACN:H2O) T
7、0 (25:75), T6.5 (25:75), T7.5(95:5), T9 (25:75), T10 (25:75) T0 (36:64), T1.1 (95:05) T1.3 (36:64) 流速 3.0 毫升/ 分钟 0.6 毫升/ 分钟 总运行时间 10 分钟 1.5 分钟 总溶剂用量（包括进样间的 0.5分钟延时） 乙腈：10.5 毫升 水：21.0 毫升 乙腈：0.53 毫升 水：0.66 毫升 Cpd A 的塔板数 2000 7500 USP 分离度 3.2 3.4 LOQ 0.2 微克/ 毫升 0.054 微克/ 毫升 残留物 分离度 标准/ 结果 /通过 2000/通过 2
8、.0/通过 1 1.30 微克/ 毫升标准重复进样。 准度是通过用校准曲线对进样波峰面积进行反向计算来得到每次进样的计算浓度来评价的。这些数值与理论值进行比较，并按照与理论值的偏差百分比（% ）形成报告。大量程和小量程试验的结果均符合验收标准（见表 III 和表 IV）。 系统适用性 共进行五次重复进样来评价系统适用性。结果通过了所有常用的USP 验收标准（见表 V）。 进样到查样试样残留 仪器中以前试样的残留物造成进样的污染可设定一个试验的LLOQ 的界限。频繁的残留会导致精度、准度和系统适用性试验的失败。然而，根据这些研究的协议细节，不可能揭示显著的残留效应。这里，我们直接测量残留物来预测
9、潜在的浓缩及稀释混合试样中产生的误差。 UPLC 仪器具有减少试样残留的设计功能：一种全新的“针中针”注射器设计以及二种分离注射器洗涤剂。在本试验中，使用 200微升甲醇进行初洗，以去除大部分有机残留物，然后用 600 微升水：ACN（90：10）来置换强溶剂，并使其余试样循环、针及阀门解决方案的构成与最初方法的条件相容。 此处，通过分析每次校正标准后的溶剂空白试样和测量分析物保持时间内出现的任何波峰的面积来评价残留情况。在五个低浓度标准进样后，未发现空白溶剂中有干扰波峰。对于最高浓度标准进样后的空白试样，噪波略上方的弱波峰的强度是上一次进样中分析物的0.01%。这在该试验中是可以接受的，尽管
10、残留物可能已通过优化洗涤溶剂参数而进一步减少了。比较起来， HPLC 系统的残留物要高出510 倍。 总结 定量表示有机溶剂提取物中杂环药物的 QC HPLC 试验已成功地传输和优化为 UPLC。初步评价表明，该试验可以通过验证。 相关指南已经编制，以推动未来UPLC 试验的发展。 UPLC 的应用具有成本优势。而每次分校的UPLC 色谱柱费用明显少于或略少于 HPLC，溶剂用量和废物处理费用应该降低一个数量级。若采用HPLC，试验时间会减少 5 倍，极大地提高了仪器投资回报率，并减少了所需的仪器总数。 参考文献 (1) A.D. Jerkovich, J.s. Mellors, and J.
11、W: Jorgenson, LCGC21(7), 660-611 (2003). (2) N. Wu, J.A. Lippert, and M.L. Lee, Chromotogr. 911(1) (2001). (3) K. K. Unger, D. Kumar, M. Grun, G. Buche!, S. Ludtke, Th. Adam, K. Scurnacher, and S. Renker, Chromatogr., A 892(47) (2000). (4) M. E. Swartz and B. Murphy, Lab Plus Int., 18(6) (2004). (5) M. E. Swartz and B. Murphy, Pharm. Formulation Quality 6(5), p. 40 (2004).
