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1、1.2 基因工程的基本操作程序,能够发光的热带鱼,基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定,基因表达载体的构建,基因工程的基本操作程序：一：目的基因的获取,获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 目的基因：主要是指能编码蛋白质的基因。例如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因等。,获取目的基因的方法：,1.从基因文库中提取,2.利用PCR技术扩增,3.化学方法人工合成,1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因组文库：用
2、限制酶切割一种生物的全部DNA，可以得到大量的DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让受体菌不停分裂。这样，每个受体菌包含有特定的基因组DNA片段，整个受体菌群体就包含这种生物的全部基因称为基因组文库。,2、部分基因文库：,部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例：cDNA文库。用某种生物发育的某个时期的mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与常用载体噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。,基因组文库的构建模式图,通过对受体菌的培养而储
3、存基因,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,cDNA文库和基因组文库的比较,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列
4、，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,如何从基因文库中得到所需要的基
5、因？,依据：目的基因的有关信息,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（1）从基因组文库中获取：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。,（2）从部分基因文库中获取（例cDNA文库的构建方法）,（3）根据已知的氨基酸序列人工合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,上述三种
6、目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，专一性差，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因，适用范围小,4.利用PCR技术扩增目的基因,称多聚酶链式反应穆里斯等人于1988年发明的。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。,利用PCR技术扩增目的基因,PCR反应,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原
7、理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本反应步骤,变性90-95C,延伸70-75
8、C,复性55-60C,PCR总结：,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA复性：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,前提条件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,模板DNA,PCR技术扩增与DNA
9、复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,人工合成,(基因比较小),DNA合成仪,从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露
10、出_。 用_切断目 的基因，使其产生_ _。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,1.过程:,二基因表达载体构建, 核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,过程:,2.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后
11、导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）,不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：,（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2） 通
12、过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；,（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,调节基 因,操纵基 因,结构基
13、因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,启动子,RNA聚合酶,启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,思考3：标记基因有什么作用？,载
14、体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意,用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,基因工程技术路线,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,（1）农杆菌转化法,特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,转化过程:,
