《RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1RNA 体外干扰肝癌 Hep 3B 细胞 VEGF 基因的表达作者：蒋冬贵夏昆刘劫罗红潘乾龙志高夏家辉 【摘要 】 目的： 通过自主构建的 RNAi 载体和体外合成 siRNA的方法，寻找能有效干扰 VEGF 基因表达的载体和 siRNA 片段治疗肿瘤. 方法：将自主构建的 pcDUVEGF1 和 pcDUVEGF2，以及体外合成的 TWvegf1 和 TWvegf2 siRNA 片段转染肝癌Hep3B 细胞，通过 RTPCR,Western Blot 和 ELISA 检测转染前后 VEGF 的 mRNA 及蛋白表达水平,以了解 RNA 干扰效果. 结果：两种 RNA 干扰的方法均能抑制 V
2、EGF 基因的表达且差异具有显著性（mRNA,0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2, P0.01;蛋白质,138, 121, 249, 227 vs 389 g/L, P0.01）. 结论：两个质粒及siRNA 片段均能有效的抑制 VEGF 基因的表达 . 【关键词】 RNAi； siRNA； 血管内皮生长因子； 肝癌细胞 【Abstract】 AIM: To construct RNAi plasmids and synthesize siRNA in vitro, transport them into Hep3B cells, so as to find some eff
3、ective VEGF RNAi plasmids and siRNA segments. METHODS: The RNAi plasmids pcDUVEGF1, pcDUVEGF2 and siRNA segments TWvegf1, TWvegf2 2were transported into Hep3B cells, and the expressions of VEGF mRNA and protein in the transfected Hep3B cells were checked using RTPCR, Western Blot and ELISA. The resu
4、lts were compared between the transfected and the normal Hep3B cells. RESULTS: There were prominent differences between the two groups in depressing the expression of mRNA (0.28, 0.47, 0.76, 0.58 vs 1.2, P0.01) and protein (138, 121, 249, 227 vs 389 g/L, P0.01) of VEGF gene. CONCLUSION: The two RNAi
5、 plasmids and siRNA segments inhibit the expression of VEGF gene effectively. 【Keywords】 RNAi; siRNA; VEGF; hepatocarcinoma 0 引言 VEGF/VEGFR 系统在恶性肿瘤中的协同表达，旁 /自分泌作用机制的确立为肿瘤的临床治疗提供了新的靶点. 在哺乳动物的细胞种发夹结构的双链 RNA 被剪切成 siRNA，在体内组装成蛋白复合体，在 siRNA 的引导下 Dicer 酶切割靶 RNA，或者以靶 RNA 为模板合成新的双链 RNA，进一步被 Dicer 识别和剪切,21nt
6、 siRNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性 RNAi 作用1-4 . 我们使用自主构建的 RNAi 真核基因表达载体 pcDU6 选择特异的VEGF 基因片段构建 VEGF 基因的 RNAi 质粒，选择特异的 VEGF基因片段体外合成 21nt siRNA，并将它们脂转入肝癌 Hep3B 细胞后，通过 RTPCR,Western Blot 和 ELISA 的方法检测它们对3VEGF mRNA 和蛋白表达的抑制作用，以期找到可靠的抑制 VEGF基因表达的质粒和 siRNA 片段，为肝癌的基因治疗提供一种新的方法. 1 材料和方法 1.1 材料 设计合成两段人 U6 promoter315
7、 至+1 的 PCR 寡核苷酸引物从人的 gDNA 中扩增出 U6 promoter（5端增加 Bgl II，3 增加 Apa I 的酶切位点）.将 PCR 产物用 Bgl II 和 Apa I 双酶切后, 再将 pcDNA3.1(-)质粒用 Bgl II 和 Apa I 双酶切，构建成 RNAi 质粒pcDU6，构建 pcDU6 的引物序列为 正向： 5 gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc, 反向:5 ttgggcccggtgtttcgtcctttccac. 根据高效 RNAi 基因片段的设计原则2 ，我们设计并从上海博亚生物制品有限公司申请合成了构建VEGF 基因 R
8、NAi 载体的寡核苷酸片段以及体外合成针对 VEGF 基因的 siRNA 的寡核苷酸片段，肝癌 Hep3B 细胞株购自 CCTCC，非必需氨基酸（NAA ） 、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶、EDTA, G418均购自 Gibcol 公司，RPMI 1640 干粉培养基购自 Hyclone 公司，脂质体 2000 Invitrogen 公司. T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（Promega 公司） ；Klenow Fragment（Takara 公司） ；DEPC （Sigma 公司）. Trizol Reagent(Gi
9、bcol BRL);174 Hinc digest DNA Marker，Taq 酶宝生物工程有限公司；AMV 逆转录试剂盒（Promega 公司） ；蛋白4质 Marker（上海生化试剂公司） ；Xfilm （上海爱克发感光器材有限公司）VEGF ELISA 检测试剂盒（Diognostics Systems 公司） ；兔抗人 VEGF 多抗（NEOMARKERS 公司） ；山羊抗兔二抗（PKD公司）. 1.2 方法 实验组为 pcDUVEGF1，pcDUVEGF2 阳性克隆和转染Tvegf1，Tvegf2 siRNA 的 Hep3B 细胞，对照组为常规培养的 Hep3B 细胞. 用 Apa
10、 I 和 BamH I 双酶切 pcDU6 质粒，分别取 RVEGF1，RVEGF2 的 Reverse,Forward，将酶切产物与双链的 RVEGF1 做连接，连接产物转化 JM109，挑取阳性克隆并测序证实后扩增质粒. 将连接上 RVEGF1 的质粒取 1 L 用 BamH I 和Hind III 双酶切，将 RVEGF2 连接到带有 RVEGF1 的质粒上并测序证实，命名为 pcDUVEGF1. 将 RVEGF3 和 RVEGF4 连接pcDU6 质粒上并测序证实，命名为 pcDUVEGF2. 将 T7 promoter 分别与TWvegf1，TWvegf2 ，TWvegf3 ，TWv
11、egf4 （均为 1g/L）退火，用 Klenow Fragment 补平. 用 T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System 试剂盒体外合成双链的RDNA，按 TWvegf1 与 TWvegf2 混合，TWvegf3 与TWvegf4 混合，分别往上述 RDNA 混合液中加入RnaseFreeDNase 1 L 于 37温浴 15 min 后立即于 95灭活酶活性 5 min，常温下冷却， Qiagen 小寡核苷酸纯化柱纯化. 所得5产物分别命名为 Tvegf1，Tvegf2 ，电泳跑 2.0 胶检测证实，-20保存待用. 按质
12、粒、寡核苷酸（dNTP 与 siRNA 的混合物）与脂质体的比例为 1 g2 L 混匀 5 min，溶于不含血清的 RPMI 1640 液中,室温 30 min 后转染 Hep3B 细胞. siRNA 转染Hep3B 细胞 24 h 后换无血清培养 24 h，取上清行 Western Blot，ELISA 检测，抽总 RNA 行 RTPCR 检测. 1.2.1VEGF mRNA 表达的检测 Hep3B 细胞用有血清的RMPI1640 培养基重悬 . 当 T25 培养瓶细胞汇合率达到 90%95%时换液，PBS 洗涤，各取 20 L 脂质体和 20 g pEGFPN1（用以了解脂转效率）,pcD
13、UVEGF1 和 pcDUVEGF2 质粒混匀 5 min后加无血清 RPMI 1640 培养基 800 L 混匀后加入到上述 T25 瓶培养的 Hep3B 细胞上，50 mL/L CO2，37温箱培养 24 h 后加G418（800 mg/L）筛选. 将阳性克隆加有血清 RMPI 1640 培养基重悬并转移到 6 孔板中培养 . 用 Trizol 抽实验组和对照组细胞的总RNA，同时用一对 actin 引物做对照，做半定量 RTPCR. 经电泳图像分析扫描得到 VEGF 与 actin 条带峰面积积分值比值作为计算 VEGF PCR 产物相对定量,比较实验组和对照组 VEGF mRNA 的表
14、达丰度. 1.2.2VEGF 蛋白的检测将实验组和对照组的变性上清跑 100 g/L 的 PAGE 胶，用 Marker 及阴阳性对照，行 Western Blot 检测. 另将实验组每种质粒、siRNA 和对照组均设 4 孔 50 mL/L CO2, 37培养 24 h 后,换无血清 RMPI 1640 培养基培养 24 h,取上清冻6存于-20. 用 VEGF ELISA 检测试剂盒的检测实验组和对照组的Hep3B 细胞分泌的 VEGF 的量. 1.2.3Hep3B 细胞生长曲线的测定将筛选出的 RNAi 阳性克隆细胞（包括空载体 pcDU6）和转染 siRNA（转染 24 h 后）接种于
15、 96 孔培养板中，设空白对照（不含细胞的 PBS）进行 MTT 法测细胞的活力. 测定 570 nm 处的吸光度 A 值，A 值的大小反映Hep3B 细胞成活数量及活性. 以时间为横坐标（ d ） ，减去空白对照的吸光度 A 值为纵坐标绘制生长曲线图. 统计学处理:SPSS10.0 软件进行 t 检验和 F 检验. 2 结果 21RNAi 质粒和 siRNA 对 VEGF mRNA 表达的影响构建好的 pcDUVEGF1 和 pcDUVEGF2 质粒，体外合成的 Tvegf1和 Tvegf2 siRNA. actin 为内参照,按 100 ng/mL 培养基的Tvegf1,Tvegf2 作用
16、于 Hep3B 细胞后 RTPCR 扩增扫描Tvegf1 组、VEGF2 组与无血清对照组比较 VEGF mRNA 表达水平明显降低， pcDUVEGF1 组、pcDUVEGF2 组与无血清对照组比较 VEGF mRNA 表达水平明显降低. 而 pcDUVEGF1 组、pcDUVEGF2 组、pcDU6 组与无血清对照组比较 VEGF mRNA 表达水平无明显差别，有血清对照组与无血清对照组比较 VEGF mRNA 表达水平无明显差别（图 1）. 2.2VEGF 蛋白质检测将实验组中 pcDUVEGF1 组、pcDUVEGF2 组、Tvegf1 组和 Tvegf2 组与对照组即无血清培7养组及 PRMPI 1640 培养基行 Western Blot 检测，发现实
