《采用慢病毒载体干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株的构建及意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《采用慢病毒载体干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株的构建及意义（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、国际妇产科学杂志2013年l2月第4O卷第6期 J Int Obstet Gynecol，December 2013，V014O，No6 565 论著 采用慢病毒载体干扰ALDH一1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株的 构建及意义 刘龙阳 张帝开 易娟娟 陈勃 张丙忠 陈志辽 梁金晓林仲秋 【摘 要】 目的：采用干扰乙醛脱氢酶1(AI DH一1)表达的慢病毒载体转染宫颈癌Hela细胞，构建干扰ALDH一1表 达的稳转株，以利进一步探讨干扰ALDH一1表达的宫颈癌Hela细胞株的生物学特性。方法：体外培养宫颈癌Hela细胞， 加入梯度浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选，确定最佳筛选浓度；取24孔板中对数生长
2、的宫颈癌Hela细胞，吸弃旧培养液， 加入400 新培养基，分别加入4种干扰慢病毒液(ALDH一1、ALDH11719、ALDH1740、ALDH1921，其中有一种具最 佳干扰效果)及1种阴性对照慢病毒液(LV3一Nc)，同时均加入Polybrene液。其中5种慢病毒液的加入量均为50 L(滴 度均为lxl0s TUmL)，Polybrene的加入量为05 txL(浓度为5 mgL)；24 h后换新鲜培养液，72 h后荧光显微镜下观察 荧光表达情况。然后采用最佳筛选浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选，以获得稳定转染的干扰ALDH一1表达的宫颈癌Hela细 胞株。结果：确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为09
3、 mgL；5种慢病毒载体均成功转染人宫颈癌Hela细胞中，经嘌呤霉素筛 选2周后成功获得稳定转染细胞株。结论：干扰ALDH一1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株成功构建。 【关键词】氧化还原酶类；乙醛；慢病毒属；遗传载体；转染；HeLa细胞 The Significance and Successful Construction ofStable Transfeclion ofHela Cells with Lenfiviral Vector uU Long-yang ZHANGDi-km，YIJuan juan，CHENQing，ZHANGBing-zhong，CHENZhiliao，LIANG
4、 Jilt-xioD，LINZhongqiuDepartment ofGynecology，Sixth AfftliatedHospital，Sun Yat-selt Ultivers (LIULong-yang，ZHANG Di-kai)；Department ofGynecological Oneology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University(CHEN Qing，ZHANG Bing-zhong，CHEN liao，LIANG Jin-xiao，LIN zaong-qiu)；DepartmentofDermatology
5、andSTD，FoshanMaternal andc HealthHospital(YIJuan-juan) Correspondingauthor：LINZhong-qiu，E-mail：linzhongqiuhotmailcom 【Abstract】0bjecfive：To construct the stable transfection Hela cell lines with lentiviral vector which may interfer the expression of ALDH-1。and to further explore the biological chara
6、cteristics between the expression of ALDH一1 and Hela cell lines MetlIotis：Hela cells were cultured in vitro，added the different concentration of puromycin to screen，and to determine the best screening concentration；Hela cellsweretestedfrom24weUplates，threw awaythe oldculturemedium，and added400 Lofne
7、w mediumtotheplates，andthen addedfourkinds oflentivirus solution(ALDHl，ALDH11719，ALDH1-740，ALDH1-921，and therewasakindoflentiviruswhichhasthebestinterferingeffect)andonekindofnegativeeontrollentivirus solution(LV3一NC)to the plates，at last added Polybrene liquid to themEvery lentivirus solution volum
8、e was added about 50 ILL(each of viral titers were lxl0。TUmL)。and the Polybrene was added about 05 IxL(concentration of5 mgL)respectivelyFresh culture medium was changedafter24hours，andobservethefluorescenceafter72hoursAtlast，usingthebest screening concentration ofpuromycinto screen the transfection
9、 Hela cellsand to get the stable transfection cell linesResults：The best screening concentration of puromycin was 09 mgL，lentiviral vectors were successfully transfected into Hela cells，and the stable transfectcd cell lines were successfully obtained after two weeksConclusions：Hela cells which has s
10、table interference of ALDH-1 were successfully constructed 【Key words】Oxidoreductases；Acetaldehyde；Lentivirus；Genetic vectors；Transfection；Hela cells (，nt Obstet Gynecol，2013，40：565567) 乙醛脱氢酶1(ALDH一1)是细胞内乙醛氧化的 基金项目：国家自然科学基金青年基金(81101979)；广东省医 学科研基金(B2011088)；广东省自然博士启动基金($2011040004639) 作者单位：510655广州
11、，中山大学附属六院妇科(刘龙阳，张帝 开)；中山大学孙逸仙纪念医院妇科肿瘤科(陈勃，张丙忠，陈志辽， 梁金晓，林仲秋)；佛山市妇幼保健院皮肤性病科(易娟娟) 通信作者：林仲秋，Email：linzhongqiuhotmailtom 解毒酶。短发夹干扰RNA(shRNA，shRNA与siRNA 不同，其含有双链，能整合到宿主细胞DNA上，其转 录产物可以自发形成发夹，结合到宿主基因组DNA 上产生稳定持久的干扰效果，故又名短发夹干扰 RNA)，以慢病毒作为载体转染入宿主细胞后可以整 合到宿主DNA上发挥稳定持久的干扰效果。研究已 发现ALDH一1是头颈部鳞状细胞癌【l1、肝癌21、乳腺 566
12、国际妇产科学杂志2013年12月第4O卷第6期 J Int Obstet Gyiflecol，December 2013，Vo140，No6 癌31、结肠癌 以及肺癌阁等的肿瘤干细胞标记物，而 关于ALDH一1与宫颈癌肿瘤干细胞之间关系的相关 研究罕见报道，同时关于干扰ALDH一1表达的慢病 毒载体转染宫颈癌细胞也少见报道。因而本研究采 用干扰ALDH一1表达的shRNA慢病毒载体来转染 宫颈癌Hela细胞，以构建干扰ALDH一1表达的宫颈 癌Hela稳转细胞株，以便进一步研究ALDH一1与宫 颈癌Hela细胞生物学特性(耐放化疗等)的相关性， 进一步明确ALDH-1与宫颈癌肿瘤干细胞之间的关
13、系。 1材料与方法 11材料人宫颈腺癌Hela细胞株(上海生命科学研究院 细胞资源中心，本科实验室保存)、OPTIMEMI培养液 (Gibco)、高糖DMEM培养基、025胰蛋白酶(Gibco)、胎牛 血清(Gibco)、嘌呤霉素(购自广州吉赛生物科技有限公司)、 购自上海吉玛制药技术有限公司的4种干扰ALDH一1以及1 种阴性对照的shRNA慢病毒载体。4种具干扰效果的慢病毒 载体序列分别为ALDH一1：5 -GTAGCCTFCACAGGATCAA-3 ， ALDH一1一homo一1719：5 一GGATICAAGATGTCTGGAAAT一3 ， ALDH一1一homo一740：5 一GGG
14、CCGTACAATACCAATFGA一3 ， ALDH一1一homo一921：5 一GCTCTccACGTGGcATCT rrA一3 ，其 中有一种具最佳干扰效果。1种阴性对照慢病毒载体序列 (LV3一NC)：5-TFCTCCGAACGTGTCACG们-rC一3 ，其虽可整 合入宿主DNA中，但不具备干扰效果。Polybrene(购自上海 吉玛制药技术有限公司)、日本尼康Tis荧光显微镜。 12实验方法 121确定瞟呤霉素的筛选浓度将25 mg嘌呤霉素粉齐 溶 于50mLPBS溶液中(终浓度为05 gL)，制备成嘌呤霉素溶 液；筛选前1天接种05xl0s个细胞孑L至24孑L板中，加入05 mL
15、含血清培养基，37、5的CO 条件下培养至4050 融合；按梯度浓度(05，06，07，08，09，10，11，12 mgL)嘌 呤霉素溶液加入24孔板中，每隔1 d换新鲜含嘌呤霉素的溶 液(浓度不变)，培养3 d，使Hela细胞全部死亡的嘌呤霉素浓 度即为筛选浓度。 122慢病毒载体转染方法转染前1 d，接种05x10 个细 胞孔至24孔板中，加入05 mL含血清培养基，37、5的 CO 条件下培养至4050融合；吸弃旧培养基，加入04 mL新鲜培养基，然后分别加入5种病毒液(体积均为50 ， 病毒滴度均为lxl0s TUmL)，最后分别加入05 IxL Polybrene (浓度为O5 g
16、L)。24 h后更换新鲜培养基，继续培养；72 h后 荧光显微镜下观察病毒侵染情况。 123稳转株的筛选将慢病毒转染后的宫颈癌Hela细胞 采用09 mgL的嘌呤霉素溶液进行筛选，每12 d换新鲜嘌 呤霉素溶液，荧光显微镜下观察荧光表达情况。筛选2周后 获得稳转细胞株。 2结果 21确定嘌呤霉素的筛选浓度嘌呤霉素筛选正常 Hela细胞3 d后，浓度I09 mgL的孔中Hela细胞全 部死亡。因而嘌呤霉素的最佳筛选浓度为09 mgL。 22慢病毒载体的转染及筛选5种慢病毒载体均 成功侵染宫颈癌Hela细胞，侵染72 h后荧光表达最 强；经嘌呤霉素筛选2周后获得4种干扰ALDH一1的 稳转株及1种阴性对照稳转株(图1，见封三)。 3讨论 ALDH一1又名乙醛脱氢酶一1，是细胞内乙醛氧 化的解毒酶。ALDHl在正常组织的干细胞中表达， 通过氧化视黄醇为视黄酸的作
