《NCLs致病相关基因CLN8真核表达载体的构建及检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NCLs致病相关基因CLN8真核表达载体的构建及检测（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1NCLs 致病相关基因 CLN8 真核表达载体的构建及检测【摘要】 目的 构建真核表达载体,为在哺乳动物细胞内验证 NCLs致病相关基因 CLN8 与 ND1 是否存在相互作用奠定实验基础。方法 采用 PCR 技术扩增 CLN8 基因, 将其亚克隆到 PEF-Flag 真核表达载体,在 HeLa 细胞中表达, 对表达产物进行 Western blot 鉴定。结果 特异扩增 CLN8 基因编码序列, 构建了真核表达载体 PEF-Flag-CLN8，在 HeLa 细胞中表达融合蛋白, Western blot 实验能够检测到表达的融合蛋白。结论 成功地构建真核表达载体 PEF-Flag-CLN8
2、, 融合蛋白在 HeLa 细胞中有效表达。【关键词】 CLN8P;真核表达; 检测Expressing and testing of CLN8P in eukaryocyte【Abstract】 Objective To verify the interaction between CLN8 and ND1in mammal cells. Methods The fragment of CLN8 gene was amplified by PCR. The amplified fragment of CLN8 was ligased with the P-Flag vector to cons
3、truct 2recombinant plasmid PEF-Flag-CLN8.The recombinant plasmid was transfected into HeLa cell and tested by Western blot. Results The fragments of CLN8 gene was amplified and ligased with PEF-Flag, digested with endonuclease and sequenced,the recombinant plasmid of PEF- Flag- CLN8 was constructed
4、correctly. Experimental result of Western blot suggested that the fusion protein can be expressed in eukaryocyte effectively. Conclusion The recombinant plasmid of PEF-Flag-CLN8 was constructed successfully. The fusion protein can be expressed in HeLa cell effectively.【Key words】 CLN8P; eukaryocyte
5、expression; tested神经元蜡样脂褐质沉积症（the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs）是一组儿童常见的进行性神经元变性疾病群，多为常染色体隐性遗传。此疾病群的主要临床症状包括快速的视力恶化，癫痫发作，进行性智力障碍，运动失调和行为变化1 。NCLs 主要组织细胞病变特征为溶酶体内脂质沉积，且沉积物中包含的主要蛋白质为线粒体 ATP 酶亚基 C（除 NCL1 中 SAP A 和D） 。目前认为 NCLs 至少由 8 种不同的基因发生突变引起（CLN1-38） 。分子基因学研究已经鉴定并克隆出此疾病群中与 6 种类型对应的 6 个基因（CLN1
6、-3, CLN5-6, CLN8） 2,其中 CLN8 位于常染色体 8p,包括 3 个外显子，编码区全长 861bp,分为外显子 2 和33 。本课题组以 CLN8 基因编码区全长为诱饵,采用酵母双杂交技术, 选择在人胎脑 cDNA 文库中筛选 CLN8P 相互作用蛋白, 已获得一靶基因 ND14 ，其编码产物在酵母体内能够与 CLN8P 相互作用5 。为了进一步论证在哺乳动物细胞内 CLN8P 与 ND1 是否存在相互作用，本实验构建了 PEF-Flag-CLN8 真核表达载体, 在HeLa 细胞中表达,对表达产物进行 Western blot 鉴定，为今后NCLs 发病机理研究奠定实验基
7、础。1 材料和方法1.1 材料 CLN8 基因由 NanbertZhong 博士惠赠。PEF-Flag 真核表达载体及抗 FLAG 的单克隆抗体、HRP 标记的羊抗鼠 IgG 二抗由上海睿星生物公司提供。Hela 细胞购自中科院细胞生物研究所上海细胞库。无支原体新生牛血清购自杭州四季清生物工程公司。DMEM 细胞培养基按组织培养与分子细胞学技术配制。ECL 蛋白印迹法检测试剂盒购自英国 Amersham Biosciences. 其他试剂均购自上海生物工程公司和北京鼎国公司。41.2 方法1.2.1 构建真核表达载体 P-Flag-CLN8 PCR 扩增 CLN8 片段, 扩增的产物采用胶回收
8、,以 Sfi 切下,并回收目的 DNA 片段,与同样酶切的 PEF-Flag 载体连接构建成质粒 PEF-Flag-CLN8。重组质粒进行限制性酶切、测序鉴定后,无水乙醇浓缩沉淀,并用紫外分光光度仪定量待转录用。1.2.2 重组质粒转染 Hela 细胞 Hela 细胞用 DMEM 培养基接种于六孔板中培养 1824h ；分别取 PEF-Flag-CLN8 质粒 2g/孔及5l/孔阳离子脂质体用无血清和抗生素的培养基稀释至 100l；将脂质体稀释液滴加到质粒 DNA 稀释液中，边加边轻轻混匀，室温静置 20min；细胞用无血清和抗生素的培养基洗两次，然后加入无血清和抗生素的培养基 0.8ml，轻
9、轻晃动使培养基覆盖全部细胞，每孔 200l 加入质粒/脂质体复合物溶液，轻晃混匀；细胞 37 、5%CO2 培养 18h，每孔加入 1ml 含正常两倍新生牛血清和抗生素的完全培养基以恢复正常的培养，培养 18h 后，每孔换上标准培养基 23ml，继续培养 16h。51.2.3 融合蛋白 Western blot 鉴定 提取细胞总蛋白, SDS-PAGE 凝胶电泳, 用抗 FLAG 的单克隆抗体,HRP 标记的羊抗鼠 IgG二抗进行 Western-blot 检测转染细胞中表达的 Flag-CLN8 融合蛋白。2 结果2.1 重组质粒 PEF-Flag-CLN8 进行限制性酶切鉴定 重组质粒PE
10、F-Flag-CLN8 用 Sfi酶切后, 0.8%琼脂糖凝胶电泳，得到两个DNA 片段, 分别约为 6.8kb 和 900bp,小片段大小与 PCR 扩增产物一致，大片段大小与 PEF-Flag 空质粒片段一致，这些均与预期值相符。2.2 融合蛋白 Western blot 鉴定 采用 Western blot 方法对表达产物进行鉴定，结果可见一蛋白质条带。参照 PAGE 胶的蛋白质Marker，此条带的分子量为 31 KD，与 PAGE 胶的条带在同一位置。Western blot 结果表明所表达的蛋白为融合表达的 Flag-CLN8。63 讨论应用酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白，在筛选过
11、程可出现假阳性。由于酵母的翻译后加工系统与哺乳动物细胞的翻译后加工系统不尽相同,某些哺乳动物细胞的蛋白需经过翻译后加工才能相互作用,对这类蛋白质该系统也不适用6 。其次, 假阳性的发生频率较高。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能,或与其他蛋白形成复合物,引起报告基因表达,使酵母出现相应表型, 而产生假阳性结果7 。虽然在酵母体内 CLN8P 与 ND1 相互作用得到了一对一验证，但是在生理条件下，蛋白质分子间的相互作用是十分复杂的，尤其蛋白质相互作用具有时间和空间特异性8 ，由此可能在操作过程中出现人为的假象。并且，酵母细胞是最简单的真核细胞，其体内蛋白质合成后加工修饰与哺乳动物相比较有明显差
12、别。因此，我们构建了带有 Flag 标签的真核表达载体 PEF-Flag-CLN8。Flag 标签有 24bp，抗体易购买，方便表达蛋白的鉴定和纯化。实验结果已证实成功构建真核表达载体 PEF-Flag-CLN8，并检测到表达的融合蛋白 Flag-CLN8P。有效解决了 CLN8P 单抗未商品化，且单抗制备周期长，费用高的局限性。为在哺乳动物细胞内验证 CLN8 与 ND17是否存在相互作用奠定了实验基础。同时，可以初步了解 CLN8 的功能，为 NCL 发病机制提供新的依据。【参考文献】1 Zeman W, Alpert M. On the nature of the “stored” li
13、pid substances in juvenile amauroticidiocy （Batten stielmeyer Vogt）. Ann Histochem, 1963, 8: 255-257.2 Wisniewski KE, Kida E, Connell F, et al. New subform of the late infantile form of neuronal ceroid lipofuscinosis. Neuropediatrics, 1993, 24: 155-163.3 Goebel HH. The neuronal ceroid-lipofuscinoses
14、. Child Neurol, 1995, 10: 424-437.4 何淑雅，肖卫纯，李洁 .酵母双杂交系统筛选 CLN8P 相互作用8蛋白. 国际遗传学杂志，2006 ，29（3 ）：161-163.5 肖卫纯，何淑雅，李洁.CLN8 与 ND1 相互作用鉴定. 中华医学研究杂志，2005，5（4 ）：1415-1416.6 Allen JB, Walberg MW, Edwards MC, et al. Finding prospective partners in the library: the two2hybrid system andphage display find a ma
15、tch. Trends Biochemci,1995,20（12）:511-5161.7 Gietz RD, Triggs Raine B, Robbins A, et al. Identification of proteins that interact with a protein of interest:applications of the yeast two2hybrid system. Mol Cell Biochem,1997, 172 （122 ）:67-791.8 Sayeon Cho, Sung Goo Park, Do Hee Lee, and Byoung Chul Park. Protein-protein Interaction Networks: from Interactions to Networks. Journal of Biochemistry and 9Molecular Biology，2004 ， 37: 45-52.
