《KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1KDR siRNA 对乳癌细胞凋亡和 NES1 与 RUNX3基因甲基化影响作者：许秀娥 徐宏伟 葛银林 张金玉 冯翠萍【摘要 】 目的 探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法 采用阳离子脂质体 Lipofectamine 2000TM 作为转染试剂,将针对人 KDR 基因的 siRNA 转染人乳癌细胞株 MCF7 敲减 KDR 基因的表达。通过 Hoechst 33258 染色观察 MCF7 细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 方法检测 NES1 基因和 RU
2、NX3 基因甲基化状态和mRNA 的转录水平。结果 靶向 KDR 的 siRNA 转染 MCF7 细胞后可诱导细胞凋亡，NES1 基因和 RUNX3 基因甲基化程度降低，出现非甲基化条带，同时 mRNA 表达上调。结论 KDR siRNA 在体外能逆转 MCF7 细胞的 NES1 基因和 RUNX3 基因甲基化，并诱导细胞凋亡。 【关键词】 RNA 干扰;MCF7 细胞;血管内皮生长因子受体 2;甲基化; 细胞凋亡2ABSTRACT Objective To investigate the feasibility and specificity of gene therapy for brea
3、st cancer by using KDR gene expression through chemically modified siRNA in vitro. Methods The siRNA was transfected into MCF7 cells by using cationic liposome Lipofectamine 2000TM to knockdown KDR gene. Apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining; methylation specific PCR (MSP) assay was used
4、to analyze the methylation status of NES1 and RUNX3 gene; the expressions of mRNA of NES1 and RUNX3 gene were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results siRNA directed against KDR induced the apoptosis of MCF7, lowered the degree of NES1 and RUNX3 methylation, the un
5、methylation appeared, and, meanwhile, upregulated the expressions of mRNA. Conclusion KDRsiRNA can, in vitro, reverse the methylation of NES1 and RUNX3, and induce apoptosis.KEY WORDS RNA interference; MCF7 cells; vascular endothelial growth factor receptor2; methylation; apoptosis恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内血管的
6、再生是肿瘤组织内3细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础。有研究认为，含激酶插入区受体(KDR)，即血管内皮生长因子受体 2(VEGFR2) 是血管内皮生长因子(VEGF) 发挥功能的主要受体，其不仅分布于组织的血管内皮细胞，也分布于部分肿瘤细胞(MCF7 细胞、HL60 细胞等)，对于肿瘤增殖与新血管形成起重要作用1。RNA 干扰(RNAi)是由双链 RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象，它通过降解具有同源序列的mRNA 而起作用，特殊设计的小干扰 RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默2。前期研究显示，KDR siRNA 转染乳癌细胞株MCF7 后可抑制细胞增殖。本研究旨在进一步探讨
7、其对 MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响，为其应用于临床提供理论和实验依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞株 人乳癌细胞株 MCF7 购自中国协和医科大学基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数 0.10 胎牛血清的DMEM(GIBCO 公司产品)培养液中，置于含体积分数 0.05 的CO2、37 饱和湿度的孵箱中培养传代。1.1.2 主要试剂 DMEM 培养基、Lipofectamine 2000TM4及 Trizol Reagent 由 Invitrogen 公司生产 ;AMV 逆转录试剂盒由Bioer 公司提供 ;细胞凋亡Hoechst 染色试剂盒(c0003)
8、为Beyotime 公司产品;基因组 DNA 修饰试剂盒由 Zymo 公司提供。1.2 siRNA 设计合成根据文献3确定 KDR siRNA 序列,其正义链为5GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3，反义链为5UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3;阴性对照 siRNASCR 序列正义链为 5UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3，反义链为5ACGUGACACGUUCGGAGAATT3。两段 siRNA 序列均行BLAST 对比确保与其他基因没有同源性。为增强 siRNA 的稳定性，对正义链进行甲基化修饰，反义链不修饰，并由上海吉玛制药技术有限公司合成。1.3 转染根据 L
9、ipofectamine 2000TM 试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照 siRNA 进行转染条件的优化。取对数生长期的细胞, 调整细胞密度，接种于 12 孔板，用含体积分数 0.10 血清、不含抗生素的 DMEM 培养，次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。siRNA 与 Lipofectamine 2000TM 分别用适量不含血清和抗生素的5DMEM 稀释,5 min 内将其混合，室温静置 20 min 后加入细胞孔中，细胞置于培养箱进行常规培养，6 h 后荧光显微镜下观察。选用siRNA 与 Lipofectamine 2000TM 最佳转染比例。1.4 Hoechst 33258
10、 染色检测细胞凋亡将处理好的盖玻片置于 6 孔板内，取对数生长期细胞，调整细胞密度并接种于 6 孔板，设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组 (每孔只加 Lipofectamine 2000TM 0.5 L)、3 个siRNA 浓度(50、100、200 nmol/L)组、错义序列(siRNASCR)组(100 nmol/L)，每组做 6 个平行孔，按 1.3 的方法进行转染。继续培养 48 h 后弃培养液，每孔加入固定液 0.5 mL，固定 10 min 后弃去固定液，使用 PBS 洗 2 次，每次 3 min，吸尽液体。每孔再加入 0.5 mL Hoechst 33258 染
11、色液，染色 5 min，弃染色液，用PBS 洗 2 次，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞位于盖玻片与载玻片之间，尽快在避光的条件下用荧光显微镜进行观察和拍照，可检测到呈蓝色的细胞核。1.5 半定量 RTPCR 检测 mRNA 表达水平收集转染 24 h 细胞，按照 Trizol 试剂盒操作说明提取细胞6总 RNA,所提 RNA 溶于 20 L 无酶水中，Eppendorf 核酸定量测定仪测 RNA 浓度和纯度，并于 8 g/L 的琼脂糖凝胶上电泳，观察RNA 的完整性。以 1 g 总 RNA 为模板，按照 AMV 逆转录试剂盒说明操作反转录成 cDNA，
12、其反应体系为 10 L，反应条件是室温 10 min，55 45 min,95 5 min，冰浴 5 min。取逆转录产物cDNA 1 L，按照 2EasyTaq PCR SuperMix 试剂盒说明书操作，PCR 反应体积 25 L，并以无酶水作为阴性模板对照。各基因 PCR扩增条件略有差异(表 1)。PCR 产物均在质量浓度 20 g/L 的琼脂糖凝胶上电泳，观察拍照,并应用天能分析软件对条带进行吸光度(A)扫描，检测各组 mRNA 扩增产物与其对应的内参照 GAPDH 或actin mRNA 扩增产物 A 值, 然后将 A 目的 /A 内参照的比值进行统计学分析。表 1 NES1 和 R
13、UNX3 基因引物序列、长度及退火温度基因长度(bp)引物序列退火温度1.6 亚硫酸氢钠修饰和甲基化特异性 PCR(MSP)提取细胞基因组 DNA，用 EZ DNA MethylationDirect KitTM 修饰试剂盒对 DNA 进行亚硫酸氢钠修饰，使未甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则无变化。以修饰后DNA 作为模板 , 分别使用甲基化和非甲基化特异性引物扩增 NES1基因和 RUNX3 基因(表 2)。每次 PCR 均设阴性对照，用双蒸水代替 DNA 进行 PCR 扩增。取 PCR 产物 10 L,在 20 g/L 的琼脂糖凝7胶上电泳，紫外线灯下照相。表 2 MSP
14、 引物长度和序列基因长度2 结 果2.1 普通显微镜下观察细胞形态的变化转染 KDR siRNA 48 h 后, 倒置显微镜下观察显示，贴壁生长的 MCF7 细胞皱缩、变圆，部分细胞死亡脱落。4 期许秀娥，徐宏伟，葛银林，等. KDR siRNA 对乳癌细胞凋亡和 NES1 与 RUNX3 基因甲基化影响 2972.2 荧光显微镜下观察 Hoechst 33258 染色后细胞形态学变化荧光显微镜下，对照组细胞核完整均一，着色暗淡，形态规则，可见少量染色质凝聚;药物作用 48 h 后可见大部分细胞质染色不均匀，染色质凝聚，细胞核裂解，有的可见核碎裂及凋亡小体。2.3 NES1 和 RUNX3 m
15、RNA 表达的变化siRNA 干预 24 h 后，100 和 200 nmol/L KDR siRNA 组，NES1 和 RUNX3 因发生甲基化而转录沉默的 mRNA 转录活性恢复，8扩增出特异性条带，但 100 和 200 nmol/L KDR siRNA 组间mRNA 表达比较差异无显著意义;未转染组、脂质体组、错义组及50 nmol/L KDR siRNA 组均无特异性扩增条带(图 1)。2.4 NES1 和 RUNX3 甲基化的状态KDR siRNA 干预 48 h 后，在未转染组、脂质体组、错义组及 50 nmol/L KDR siRNA 组甲基化引物扩增出条带，而非甲基化引物未扩
16、增出条带;100 和 200 nmol/L KDR siRNA 组均同时出现甲基化和非甲基化条带(图 2)。3 讨 论研究表明，阻断 KDR 表达可诱导细胞凋亡6 。本实验结果与该结论一致。siRNA 是 RNAi 作用中不可缺少的重要环节7。体外合成 siRNA 的应用则是 RNAi 技术的新发展，尤其是在特异性抑制哺乳动物基因方面，既可以特异性地抑制、降解同源 mRNA 序列，有效阻止相应蛋白表达;又可避免长链 dsRNA 引起的非特异性基因降解和细胞死亡，为哺乳动物细胞的基因治疗开辟了新的途径8。DNA 甲基化状态的改变可导致基因结构和功能的异常，而其与乳癌发生的关系是近年来研究的热点。DNA 甲基化状态与基因表9达呈负相关。研究表明，抑癌基因 CpG 岛甲基化导致基因失活和转录抑制9。NES1 又称人组织激肽释放酶 10(Kallikren10)
