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1、1K562 细胞外泌体诱导特异性 CTL 生成的研究作者：陈绍倩，杜英，王鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明【摘要 】 为了研究人白血病细胞株 K562 细胞分泌的外泌体(exosomes)及 K562 细胞总 RNA 刺激人树突状细胞（DC）分泌的外泌体能否诱导出 K562 细胞特异性 CTL，采用四步离心法提取K562 细胞及 K562 细胞总 RNA 刺激人树突状细胞的培养上清液中的外泌体，并诱导 CTL 生成，以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测 CTL 对 K562 细胞的杀伤作用。结果显示：K562 细胞外泌体和 K562 细胞 RNA 刺激的 DC 和外泌体均能明显促进对 K562 细胞的杀
2、伤活性，与未经外泌体作用的对照组相比有显著性差异（P0.05） 。外泌体作用后对 K562 细胞的杀伤作用明显比对 HL-60 细胞的杀伤作用强，其差异有显著性（P0.05） 。结论：K562 细胞外泌体能够诱导出特异性抗白血病细胞的免疫反应。 【关键词】 K562 细胞；树突状细胞；外泌体；细胞毒 T 淋巴细胞Production of Specific CTL Induced by Exosomes Derived from K562 Cells2AbstractThe aim of this study was to investigate whether exosomes derive
3、d from K562 cells and human monocyte-derived dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of K562 cells are capable of inducing antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses in vitro. DCs were generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of healthy volunteers in the prese
4、nce of GM-CSF and IL-4, and then were transfected with K562 RNA by using DOTAP lipofection. Exosomes was extracted from the supernatant of DCs and K562 cells. The T cell were activated to be tumor specific CTL after DCs and exosomes were co-cultured with autologous T cells derived from healthy volun
5、teers PBMNC. The effect of CTL on K562 cells was detected by MTT assay. The results showed that treatment of T cells with exosomes derived from K562 cells or DCs transfected with total RNA of K562 cells could significantly promote their killing ability on K562 cells as compared with untreated T cell
6、s (P0.05). The killing ability of T cells treated with exosomes on K562 cells was stronger than on HL-60 cells (P0.05). It is concluded that the specific CTL immune response to leukemia cells can be induced by exosomes derived from K562 cells.3Key wordsK562 cell；dendritic cell；exosome；cytotoxic T ly
7、mphocyte外泌体（exosome）是一种直径在 50-90 nm 的亚细胞双层膜颗粒,抗原呈递细胞衍生的外泌体携带有丰富的抗原呈递所需要的MHC-、MHC-、共刺激分子和热休克蛋白等分子；肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相关抗原，能诱导肿瘤相关抗原的特异性 CTL 反应，是一种有效的抗原转运呈递载体1,2 。Zitvogel 等3的动物体内实验结果显示，用实体肿瘤抗原冲击树突状细胞（DC） ，其外泌体可以诱发荷瘤小鼠的肿瘤排斥效应。Morse 等4的一期临床实验用非小细胞肺癌 MAGE-A3 或 A4 抗原冲击进展期非小细胞肺癌患者(MAGE 抗原阳性)自体树突状细胞，获得 DC衍生的外
8、泌体，这种携带 MAGE 肿瘤抗原的 DC 衍生的外泌体可以诱导 MAGE 特异性 T 细胞反应并使一部分病人的病情得到缓解和控制，提示 DC 衍生的外泌体可以作为无细胞治疗性肿瘤疫苗用于肿瘤的免疫治疗。外泌体在实体肿瘤方面的研究报告较多，而在白血病方面的报告却甚少，因此我们提取了白血病细胞株 K562 细胞及K562 细胞总 RNA 刺激人树突状细胞的外泌体，观察了其诱导的抗白血病细胞的作用，发现其外泌体能诱导 K562 细胞特异性 CTL，现报告如下。4材料和方法主要试剂标准胎牛血清、淋巴细胞分离液(TBD 公司产品); rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2(Peprotech 公
9、司产品 )；完全培养基 RPMI 1640（Gibco 公司产品） ;小鼠抗人 MHC-I、 MHC-II、CD54（ICAM-I） 、CD86（B7-2） 、CD80（B7-1 ） 、CD40 单克隆抗体（Ancell 公司产品） ；胶体金标记马抗小鼠 IgG(华美公司产品)。二甲亚砜、四甲基偶氮唑蓝(Sigma 公司产品)；TRIzoL 试剂(Invitrogen 公司产品)；DOTAP 脂质体（ Roche 公司） 。细胞株培养K562 细胞株 和 HL-60 细胞株系郑州大学基础医学院保存株。K562 和 HL-60 细胞于含 10% 的胎牛血清 (56灭活 30 分钟) 、1105
10、U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素、510-5mol/L 2-巯基乙醇和 110-3 mol/L 谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养液，在 37、5% CO2 培养箱中培养。K562 细胞总 RNA 制备5按照 TRIzoL 试剂说明书抽提处于对数生长期的 K562 细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性，紫外分光光度仪测定A260 和 A280 数值。DC 的诱导和培养从正常人外周全血细胞获得贴壁细胞，调整浓度至5105/ml，悬浮培养于 RPMI 1640 完全培养液中，分别加入终浓度为 100 ng/ml rhGM-CSF 和 500 U/ml rhIL-4, 隔天半
11、量换液，补充新鲜培养液及细胞因子以诱导生成 DC。取上述制备的 K562 细胞总 RNA (25 l /250 l Opti-MEM)和 DOTAP (50 l /250 l Opti-MEM)各 250 ml，室温下在聚苯乙烯试管中混合 20 分钟,混合物加入培养 5 天的 DC，在 37培养箱孵育 4 小时。4 小时后吸出培养上清,加入含 rhGM-CSF 和 rhIL-4 的 RPMI 1640 完全培养液继续培养。外泌体的提取取对数生长期的 K562 细胞和 K562 细胞总 RNA 刺激的 DC的培养上清，按文献外泌体 4 步离心法分离 5,6 ，即：4 300 g 离心 10 分钟
12、; 1 200 g 离心 30 分钟；10 000 g 离心 30 分钟；最后，100 000 g 超速离心 60 分钟，所获得的沉淀即为外泌体。6用 PBS 将外泌体，100 000g 超速离心 60 分钟，洗 1 遍后，用PBS 100 l 重悬,用 BCA 法进行定量，低温保存备用。K562 细胞外泌体刺激 DC 诱导 CTL 的生成外周血非贴壁细胞过尼龙毛柱获得 T 细胞，加入 IL-2(终浓度5105 U/L)培养扩增。上述外周血 DC 培养 5 天后分组，一组加入终浓度为 20 g/ml 的 K562 细胞外泌体与 DC 共孵育 24 小时作为实验组 DC，另一组不加外泌体继续培养
13、 24 小时作为对照组 DC。将实验组和对照组的 DC 和 T 淋巴细胞按 120 混合，继续培养 3天诱导 CTL 生成，然后加入靶细胞 K562 细胞和 HL-60 细胞，效靶比为 201，MTT 法测 2 组 T 细胞对 K562 细胞和 HL-60 细胞的杀伤活性7 。CTL 杀伤活性 =靶细胞对照组 A 值-（实验组 A 值-效应对照组A 值） /靶细胞对照组 A 值100% 。RNA 刺激的 DC 及外泌体诱导 CTL 的生成取第 7 天 K562 细胞总 RNA 刺激 DC(实验组 DC)和未刺激DC(对照组 DC)，同上述方法诱导 CTL 生成，并测 2 组 T 细胞对K562
14、 细胞的杀伤活性。取 RNA 刺激的 DC 和未刺激的 DC 分泌的外泌体各 10 g/ml，分为 2 组：未刺激 DC 分泌外泌体组(对照组)7和 RNA 刺激 DC 分泌 外泌体组（实验组） ，诱导 CTL 生成，用上述方法测各组对 K562 细胞的杀伤活性。统计学分析实验数据以 XSD 表示，应用 SPSS 11.0 统计软件进行统计学处理，采用 2 检验，以 a = 0.05 为检验水准。结果外泌体、RNA 和 DC 的鉴定目前对外泌体的鉴定主要依赖形态学观察和蛋白组成分析。我们对从培养上清液中所提取的分离样品进行了电子显微镜超微结构的观察、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
15、蛋白带型的分析及标志性分子的 Western 胶体金免疫方法检测，结果表明我们的分离样品正是外泌体。同样也对所提取的 K562 细胞 RNA 做了琼脂糖凝胶电泳，用紫外分光光度仪测定其 A260 和 A280 数值，检测证明所提取的 K562 细胞 RNA 未降解。所诱导的 DC 在形态和标志性分子的表达测定也表明诱导出了典型的树突状细胞。K562 细胞外泌体诱导的 CTL 细胞杀伤活性8我们用常规四步离心法提取 K562 细胞培养上清液中的外泌体，后者作用于 DC 并诱导 CTL 生成，以 K562 细胞作为靶细胞，观察对其杀伤作用。在效靶比为 201 和 401 时，外泌体作用后诱导的 C
16、TL 对 K562 细胞的杀伤率 (实验组)和外泌体未作用诱导的CTL（对照组）对 K562 细胞的杀伤率相比较，实验组杀伤活性明显增高(P0.05)。外泌体作用后的 CTL 对 K562 细胞的杀伤率 (实验组)与对 HL-60 细胞的杀伤率相比较，外泌体作用后的 CTL 对 K562细胞的杀伤率也明显增高(表 1)，提示外泌体作用后的 CTL 对 K562细胞的杀伤有特异性。这说明 K562 细胞外泌体作用于 DC 后诱导的 CTL 对 K562 白血病细胞有特异性杀伤活性。Table 1. Killing activity of CTL induced by K562 cell exosomes to K562 cells and HL-60 cells（略）RNA 刺激 DC 及外泌体诱导的 CTL 生成用 RNA 提取试剂盒提取 K562 细胞 RNA，然后用提取到的RNA 刺激正常人树突状细胞并
