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1、临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 1 页第十三章 免疫组织化学技术第一节 概述第二节 免疫荧光组织化学技术第三节 酶免疫组织化学技术第四节 亲和组织化学染色第五节 免疫标记电镜技术第六节 免疫组织化学技术的应用第一节概述 免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性和分子生物学技术的敏感性等巧妙地结合在一起，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。 免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可
2、分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术。 免疫组织化学的基本过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将标志物与抗体结合形成标记抗体；标本的处理与制备；抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；观察结果。 一、标本的处理（一）刺液； （二）标本的固定与保存 冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。 二、临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 2 页三、抗体的处理与保存（一）抗体的选择选择抗体时应注意选择具有高度特异性和稳定的优质抗体，根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。多克隆抗
3、体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。（二）抗体的稀释抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。实际操作中需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度，以便达到最小背景染色下的最强特异性染色。（三）抗体的保存抗体是一种具有生物活性的蛋白质，在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。四、免疫组化的结果判断（一）对照的设立 设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。 （二）阳性结果 阳性细胞
4、的显色分布有三种类型：细胞质；细胞核；细胞膜表面。 （三）阴性结果及抗原不表达阴性结果不能简单地认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。（四）分布于特定抗原部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，具有结构性。非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。如果细胞之间显色强度相同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的着色，常提示为非特异性反应。过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显色同时存在，过强的
5、非特异性显色背景可影响结果判断。（五）免疫组化结果与 片结果五、质量控制（一）试剂的质量控制（二）操作步骤的质量控制（三）技术设备、仪器和器具的质量控制第二节免疫荧光组织化学技术 免疫荧光组织化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原（或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。 临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 3 页一、组织处理（一）标本的类型 二）标本的保存 标本在固定干燥后，最好立即
6、进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置 4以下保存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存 1 个月以上。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在20以下保存。 第三节酶免疫组织化学技术 酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。 一、组织处理（一）标本的类型 荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫
7、组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。 二、酶标记抗体免疫组化染色借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，通过酶对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，沉淀在靶抗原位置，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。 （一）直接法将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原后用酶底物显色。直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，制备的抗体种类有限。 （二）间接法 将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗
8、体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原后用底物显色剂显色。间接法的优点是检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。三、非标记抗体免疫酶组化染色（一）酶桥法抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原底物显色。 临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 4 页（二）是在酶桥法基础上的改良。首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（合物）。该复合物由 2 个抗酶抗体和 3 个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与 合物的
9、抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。 （三）双桥 在 中通过两次连接桥抗体和 合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的 合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与 合物中抗酶抗体的未充分饱和 结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的 结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测有实用价值。 （四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（） 辣根过氧化物酶（免疫组化的首选用酶，但有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了 广泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。就是用碱性磷酸酶代替 立的碱性磷酸
10、酶（抗碱性磷酸酶（，即简称 四、酶免疫组化染色中常用的酶及显色底物酶免疫组化技术中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺（反应产物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（反应产物呈橘红色；4应产物为灰蓝色。 碱性磷酸酶为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色。其他标记酶还有葡萄糖氧化酶（者底物为葡萄糖，配以 蓝色沉淀。 对含有丰富内源性过氧化物酶的组织切片（如淋巴组织和肿瘤组织），则首选 记的免疫组化方法。理论上 为敏感，但 色结果保存时间长。 合可进行双重或三重免疫组化标记。第四节亲和组织化学染色 亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的方法。一、生物素）亲和素一定比例将亲和素与酶标生
11、物素结合 ，形成可溶性亲和素当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与 记体系连成一体进行检测。 的优点：敏感性高。生物素与亲和素的结合十分牢固，并且 1 个分子亲和素有 4 个生物素结合位点，可以分别和生物素化的抗体和酶结合，1 个过氧化物酶或免疫球蛋白分子又可结合多个生物素分子，从而形成网络状复合物。此外，尚具有亲和力强、特异性高、第一抗体和第二抗体工作浓度低、操作时间短、可以多重标记等特点。 （二）桥联亲和素术）是以游离的亲和素作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反应体系中抗原、生
12、物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）联结起来，达到检测反应分子的目的。 （三）标记亲和素术）临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 5 页是以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法具有相当高的灵敏度，由于省略了加标记生物素步骤，操作较 简便。间接 采用的是生物素化的第二抗体，可以进一步提高检测灵敏度。 二、葡萄球菌 A 蛋白法葡萄球菌 A 蛋白技术是根据 与多种动物 结合的原理，用 志物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测实验。用 记，可应用于间接法。的染色程序基本同酶标抗体法，仅第二抗体改用 三、凝集素法凝集素可采用直接法和间接
13、法进行细胞化学染色。直接法：将标志物直接结合在凝集素上，使其与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合；间接法：先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体（即用凝集素免疫动物制备抗凝集素抗体）与结合在细胞上的凝集素反应。 四、链霉亲和素A）是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有 4 个生物素结合位点 ，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲和素。利用生物素结合的第二抗体与酶标记的链霉亲和素蛋白就构成了酶标链霉亲和素 五节免疫标记电镜技术 一、免疫标记电镜技术的原理免疫电子显微镜（术是利用高电子密度的颗粒性标志物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织细胞化学反应能产生高电子密
14、度产物者如辣根过氧化物酶标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。 之免疫组织化学在光镜下的定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点。 二、免疫标记电镜技术标本制备的要求免疫标记电镜技术标本制备的要求是既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强，在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。三、常用的免疫标记电镜技术（一）免疫胶体金染色法免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗
