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1、重组质粒的酶切鉴定及 PCR 实验崔文强 201300140012 生态同组者：陈斌 郝书平摘要 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是 1986年由 Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握酶切和 PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。关键词 酶切；重组质粒；插入片段；PCR1.引言将含有外源 DNA的转化子的 E.coliDH5 菌株进行培养，并用试剂盒
2、提取其质粒DNA，将所提取的 DNA用切 pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小，这就是重组质粒酶切鉴定。接着进行 PCR检验，PCR 是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶 DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的 DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的 DNA 得以迅速扩增。置待扩增 DNA 于高温下解链成为单链 DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA 聚合酶在 72将单核苷酸从引物 3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成 DNA 新链
3、。由于每一循环所产生的 DNA均能成为下一次循环的模板，所以 PCR 产物以指数方式增加，经 2530次周期之后，理论上可增加 109倍，实际上可增加 107倍。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的 TaqDNA 聚合酶缺乏 53核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每 9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。2.实验材料和方法2.1 实验材料PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml 薄壁 PCR管，凝胶成像仪 ，模板pUC19重组质粒，寡核苷酸引物（上游
4、引物 M13F，下游引物 M13R），TaqDNA 聚合酶（TaKaRa，-20贮存），dNTPs（TaKaRa，-20贮存），10PCR 反应缓冲液（TaKaRa，-20贮存） 高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE 电泳缓冲液(10)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)， DNA 相对分子质量标准物 DNA Marker k Hind，DL5000。2.2 实验方法2.2.1重组质粒的酶切、电泳检测对于电泳显示插入片段在 2.0kb以上的重组质粒，采用 Hind酶切进行验证。大片段或高产量的重组质粒推荐的反应
5、体系（10l 体系）如下：表 1 质粒酶切反应体系成分 体积（l） *4dd H2O 6.2 2610Buffer（含 Mg2+） 1.0 4Re-Puc19 2.0Hind（15U/l） 0.8 3.2共计 10.0 8L/tube轻弹混匀后，短暂离心，于 37 孵育 1.5hr后，保存于 -20，备电泳检测。取酶切产物 10 ul，加入 2 ul 10loading buffer，混匀后点样。取重组质粒 2 ul，加入 4L dd H2O，1 ul 10loading buffer，混匀后点样。以 DNA/HindIII为 Marker，点样顺序如表 2。100V 恒压电泳约 40min。
6、电泳结束EB染色 10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。表 2 重组质粒酶切上样顺序泳道 1 2 3 4 15 16 17 18样品 /HindpUC19/HindRp1-1 rp1-1 HindRp7-1 Rp7-1 HindpUC19/Hind/ Hind样量L10 5 10 10 10 10 5 10作用 M对照 对照 对照 M对照2.2.2重组质粒的 PCR验证对于电泳显示插入片段在 2.0kb以下的重组质粒，采用 PCR进行验证。引物此次重组用到的载体是 pUC19，限制性内切酶为 Hind ，所以选择 Hind 酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。由于载体 pUC19上两引物间序
7、列的长度是 150bp，所以 PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。实验中首先建立反应体系：表 3 PCR 引物引物名称 引物序列 5 3 引物长度(mers) Tm()M13F(-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC 24 64.7M13R(-48) GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 24 57.9表 4 PCR 反应体系建立体系后将加好样的 PCR管进行标记，放入 PCR仪中，设定反应基本参数如表 5所示表 5 PCR 反应程序项目 温度/ 时间预变性 94 3min变性 94 30s复性 58 30s延伸 72 75s终延伸 72 1
8、0min保存 4 2hr（1） 预变性：让 DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板 DNA的二级结构充分打开。（2） 变性：通过加热使 DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA。（3） 复性：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物 DNA量大大多于模板 DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA双链之间互补的机会较少。（4） 延伸：在 DNA聚合酶和 4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下 ， 5-3的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA链延伸反应。（5） 终延伸：循环完
9、成后 使 PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通 Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加 A尾的作用，可以直接用于 TA克隆的进行。PCR结束之后对产物进行电泳检测，用 1%的琼脂糖凝胶电泳：20ulPCR 产物中加 3.0ul 编号 组分 加量（ul）1 dd H2O 13.22 10Buffer（含 Mg2+） 2.03 dNTP（2.5 mM each） 1.64 M13F（10M） 15 M13R（10M） 16 模板（1-10ng/l） 1.07 Taq酶（5u/l） 0.2总体积 20.025cycles10loading buffer，混合均匀，取 5ul 点样，上样顺序如表 6。
10、以 DL2000和 DL5000为Marker。100V 恒压电泳约 40min。电泳结束 EB染色 10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。表 6 PCR 产物上样顺序泳道 1 2 3 8 9 10 11样品 DL2000 1-1 1-2 4-1 4-2 DL5000 DL2000样量 L 5 10 10 10 10 5 5作用 Marker Marker Marker3.实验结果和分析3.1 实验结果3.1.1重组质粒的酶切电泳结果将重组质粒酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳，成像如图 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18图 1重组质粒酶切凝胶
11、电泳成像图第 3、4 泳道是我们组的结果，分别是重组质粒和酶切后的重组质粒，因为插入片段很小，所以酶切是借用的 2组的质粒。由泳道 3可以看出重组质粒大小与 DNA/Hind中 4361的条带大致平齐，推测其大小为 4300，泳道 4中自上而下一共五条带，最上面的条带 ，第 2条带是切开的 pUC19载体，下面三条分别是酶切开的大小为 2027、564 和 125bp的片段。3.1.2重组质粒的 PCR验证结果1. 琼脂糖电泳展示的克隆片段的 PCR扩增结果如下图： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 图 2 重组质粒的 PCR验证结果我们组的结果是第 2、3 泳道，与 DL200
12、0marker对比来看，大小比 250bp的条带稍大，减去两引物间序列的长度 150bp，可以得出插入片段的大小是 125bp。4.讨论4.1 注意事项（1） 限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是 DNA样品还是酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；（2） 酶切反应的所有塑料制品（Eppendorf 管、吸头等）必须是新的，并经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要求环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短 Eppendorf管的开盖时间。（3） 注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和 DN
13、A，最后加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后立即放回冰箱，防止酶的失活。（4）Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)，复性温度=Tm 值-(510)，本实验两个引物的 Tm分别为 64.7，57.9，选用退火温度为 58，这是因为在 Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR反应的特异性。4.2 PCR 反应的要素PCR反应五要
14、素：参加 PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR 引物为 DNA片段，细胞内 DNA复制的引物为一段 RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要 Mg2+）。（1）PCR 引物设计PCR反应中有两条引物，即 5端引物和 3引物。设计引物时以一条 DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段 5端上的一小段 DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段 3端的一小段 DNA序列互补。引物设计的基本原则引物长度：15-30bp，常用为 20bp左右。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避
15、免 5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免 3 端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3末端连续 8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和 C。引物的 5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。（2）模板的制备聚合酶链锁反应 PCR的模板可以是 DNA，也可以是 RNA。模板的取材主要依据 PCR的扩增对象，标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶 K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加 EDTA处理。所得到的粗制 DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作 PCR反应模板。（3）反应的控制PCR 反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子镁离子浓度 总量应比 dNTPs的浓度高，常用 1.5mmol/L底物浓度 dNTP 以等摩尔浓度配制，20200umol/LTaqDNA 聚合酶 2.5U(100ul）引物 浓度一般为 0.1 0.5umol/L反应温度和循环次数变性温度和时间 95，30s退火温度和时间 低于引物
