酶免疫测定(ELISA)介绍

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1、1酶免疫测定（ELISA）一、ELISA 技术介绍1、抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM 、IgD 和 IgE。与免疫测定有关的 Ig 主要为 IgG 和 IgM。Ig 由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig 的轻链是相同的，有 （kappa ）和 （Lambda ）两种型别。五类 Ig 的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重链分别称为 （gamma）链和 （mu ）链。重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用 VH 和 VL 表示。

2、两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹 配，发生特异性结合（见图） ，是抗体专一性结合抗原的结构基础。 IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab） 。每个 Fab 都保存结合抗原的能力，但只有一 个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称 Fc 段，无抗体活性，但具有 IgG 特有的抗原性。 IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个 Fab 双体，称 F（ab）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似 Fc，随后被分解 成小分子多肽，无生物活性。IgM 是由五个单体组成的五聚体，含 10 个重链和 10 个轻链，具有 1

3、0 个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM 分子量约为 900000， IgG 分子量约为 150000。机体被微生物感染后，先产生 IgM 抗体，然后产生 IgG 抗体。经过一段时间，IgM 抗体量逐渐减少而消失，而 IgG 抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年 之久。IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此 IgM 抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎 病人血清中 IgG 抗体和 IgM 抗体出现的时间和水平。2、抗原抗体反应（1）可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb抗

4、体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数 K 表示：K=AgAbAgAbAgAb 的解离程度与 K 值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离 后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的 IgG 抗体仅占总 IgG 中 的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。 2（2）最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图 1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（z

5、one of equivalence） 。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中 称为带现象（zone phenomenon） 。抗体过量称为前带（prezone） ，抗原地过量称为后带（postzone） 。在用免疫学方法测定抗 原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。 （3）特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原 抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（ HBsAg） 、e 抗原（HBeAg）和核

6、心抗体（HBcAg） ，随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体 反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物 。但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素（ hCG）和黄体生成激素（LH）均由 和 两个亚单位组成，其结构的不同处在 亚单位，而两者的 亚单位是同类的。用 hCG 免疫 动物所得的抗血清中含有抗-hCG 和抗 -hCG 两种抗体，抗 -hCG 抗体将与 LH 中的 酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗 hCG

7、抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中 hCG，只能用于 hCG 浓度较高的试验，否则 妇女生理性排泄入尿液中的微量 LH 将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到 50mIu/mlhCG）的实际中必须 应用只对 hCG 特异的抗 -hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。 （4）敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为 mg/ml 水平，酶反应测定法的敏感度约为 510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免 疫测定的敏感度可提高数千倍，达 ng/ml 水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定 HBsAg，其敏感度可达0.1ng /

8、ml。3、免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原 ，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。3) 抗生素和药物。4) 病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等。5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等。4、标记的免疫测定3如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达 510g/ml，但在临床检验中，某些待测物

9、在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是 将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别 为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中， 一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体（Ab ）检测抗原（Ag）为例，反应式如下：Ag+ Ab AgAb+ Ab在反应产物中有与 Ag 结合的 Ab和游离和 Ab ，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫

10、测定中的重要步骤。可采 用多种手段，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物被固定在载 体上，而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的 Ab 除去，结合标记物的测定可在固相上进行。5、酶免疫测定酶免疫测定（enzyme immunoassay）可分为均相（homogenous）和非均相（heterogenous）两种类型。在均相 EIA 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相 E

11、IA 在临床检验中较少应用。非均相 EIA 需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述，固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在 1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay） ，简称 ELISA，在国内有译作酶联免疫吸附试验的，虽然含义不完全确切，但已习用。二、ELISA 的原理和类型1、ELISA 的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与

12、固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是，ELISA 技术只能检测到 ng 水平，精密度差（批内 CV15-20%） ，线性范围窄（一个数量级） ，存在“HD-HOOK”效应。42、ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也

13、可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：固相的抗菌素原或抗体，即 免疫吸附剂 （immunosorbent ） ；酶标记的抗原或抗体，称为 结合物（conjugate） ；酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型：（1）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复

14、合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作

15、一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物 。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect） ，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱

16、钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBsAg 有adr、adw 、ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。 RF 是一种自身抗体，多为 IgM型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F（ab）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc 段，从而消除 RF 的干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见 6.2） 。5双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半