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1、酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理： 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性 标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 加入酶底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅对标本中的抗原或抗体定性或定量分析。ELISA 中最常用的酶: 辣根过氧化物酶（HRP） 、碱性磷酸酶（AP）ELISA 的技术要
2、点：试剂的准备、反应条件的选择、操作的标准化双抗体夹心法操作步骤(检测抗原)：1.特异性抗体+固相载体固相载体，洗去未结合抗体及杂质 2.待测样品+固相抗体固相抗原抗体复合物，洗去杂质 3.酶标抗体与固相免疫复合物结合，洗去未结合酶标抗体 4.加入底物，固相载体上的酶催化底物生成有色产物双抗体夹心法基本原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于固相抗体和酶标抗体相对过量，所以复合物的形成量与待检抗原的含量呈正比。间接法（检测抗体）：原理是利用酶标记的抗抗体检测已与固相抗原结合的待测抗体。 步骤 1
3、.特异性抗原+固相载体固相抗原，洗涤 2.加待测血清，抗体与固相抗原结合，形成固相抗原复合物，洗涤，固相载体上仅剩下特异性抗体 3.酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合 4.加入底物显色，颜色深浅代表样品中待测抗体量掌握 ELISA 的测定方法的标准化：包被、封闭、点样、洗涤、孵育、终止反应、结果判定包被：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，抗原或抗体固相化的过程称为包被，必须在包被缓冲液中进行其机制分为物理性吸附和共价交联。包被的目的是让大量不相关的蛋白质填充间隙，从而排斥 ELISA 后的步骤中干扰物质的在再吸附。常用封闭剂有 BSA,脱脂奶粉，37 摄氏度处理 1 小时加样：力求准确，加样时应
4、将液体加在孔底，力求不产生气泡洗涤：目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。Tween20 最为常用，洗涤效果好，减少非特异性吸附并加强特异性结合孵育：37 摄氏度，处理 45 分钟流式荧光免疫技术的工作原理（自己概括）：将经荧光抗体染色的单个细胞悬液和鞘液分别经硅化管道进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态层流，通过喷嘴高速射下，与水平方向的激光垂直交汇。 细胞一个一个被入射光（激光）激发并产生荧光，同时产生散射光。由于细胞大小和胞内颗粒多寡而对激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受；细胞上着染的荧光素在激光激发下发出的荧光由荧光检测器接受。全部接受
5、的光信号输入计算机进行数据分析处理，获得细胞类群和数量的信息 。细胞分离纯化系统在分析鉴别不同细胞类群的基础上，可使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场发生偏离，最后将细胞分别收集于不同容器内。50%绵羊红细胞溶血法测定原理：绵羊红细胞与相应抗体结合成的复合物可活化补体经典途径，使补体 C1-C9 相继在红细胞表面发生级联反应而形成跨膜小孔，细胞外水分渗入，导致红细胞胀裂而发生溶血。当红细胞和溶血素量一定时，在规定时间内，溶血程度与补体活性呈正相关。在轻度溶血和接近完全溶血时，溶血率对不体谅变化不敏感；在 30%-70%溶血率之间，补体量的微小变化可使溶血率发生很大变化。以 50%溶血作为终点更适合
6、，该方法称为补体 50%溶血抗原抗体反应的原理：Ag 决定簇和 Ab 分子超变区相互作用(相互吻合,具有互补性)，抗原抗体反应是抗原与抗体之间特异性结合的反应，分为两个阶段。第一阶段是抗原与抗体特异性结合，时间短，无可见反应；第二阶段为可见反应，出现沉淀、凝集、补体结合、溶解等肉眼可见的反应离子交换层析步骤：1 平衡阶段：离子交换剂与平衡离子结合 2.交换阶段：样品与平衡离子交换 3.阶段洗脱：缓冲液洗脱，结合力弱的分子洗脱下来 4.终末洗脱：结合力强的分子洗脱下来 5.再生阶段：酸或碱处理，再用洗脱液平衡，即可恢复初始状态层析凝胶步骤：1.样品液上住 2.小分子被滞留在凝胶颗粒内部，大分子被
7、排阻在凝胶颗粒外面，向下移动 3.大小分子完全分开 4.大分子流出层析柱，小分子留在柱内荧光抗体各种染色法需要设置的对照：1.标本自发荧光对照：标本只需加 12 滴 PBS 缓冲液或不加 2.特异性对照（抑制试验）：先用未标记的特异性抗体处理标本，使之与特异性抗原结合，再用标记的特异性抗体复染，则荧光染色复染 3.荧光抗体对照：适于间接染色法。标本加标记抗球蛋白抗体（如如标记的羊或兔抗人免疫球蛋白）4.补体对照：适于补体染色法。标本加 1：10 稀释新鲜豚鼠血清，再加标记抗补体抗体 5.阳性对照：直接法为在已知的阳性标本上加标记抗体；间接法为标本加已知的阳性血清，再加标记抗球蛋白抗体。如果 1
8、4 均呈无荧光或弱荧光，对照 5 和待检标本呈荧光阳性，则为特异性荧光染色细胞因子：是由活化免疫细胞和某些基质细胞分泌的，能介导和调节免疫反应、炎症反应的小分子多肽 按生物学功能分类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子、趋化因子细胞因子的检测方法：1.生物学测定法是检测细胞因子某种特定的生物学活性 2.免疫学测定法是用免疫学检测技术将细胞因子作为蛋白质抗原，用相应的特异性抗体进行测定；此法所测定的是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性并不一定成正比；分子生物学测定法检测细胞因子相应的 DNA、RNA，反映的是细胞因子基因及其表达情况。抗原抗体反应的类型：1. 凝集反应：颗粒性
9、抗原与相应抗体结合 2.沉淀反应:可溶性抗原与相应抗体结合 3.补体参与：细菌抗原与相应抗体结合表现为溶菌反应，红细胞与相应抗体结合表现为溶血反应 4. 中和反应：细菌外毒素或病毒与相应抗体结合 5.标记免疫反应抗血清的鉴定：效价的鉴定，特异性鉴定，亲和力鉴定，纯度鉴定单克隆抗体的鉴定：Ig 类型和亚型、特异性、抗体效价、决定簇、亲和性的测定，单克隆抗体中和活性的鉴定抗原抗体反应的影响因素：1.反应物自身的因素，包括抗原(Ag 决定簇数量，Ab 决定簇种类)和抗体（来源、特异性与亲和力、浓度）2.反应环境条件，包括电解质 0.85%NACL、酸碱度 Ph6-8、温度 37 度常用。抗原抗体反应
10、的特点：阶段性、比例性、可逆性、特异性。带现象：在抗原抗体反应的等价带前后分别为抗原过剩带和抗体过剩带，沉淀物形成量少，如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成的现象称为带现象。非特异性免疫刺激剂：超抗原、丝裂原、佐剂抗原抗体纯化的方法：离心分离法、盐析法、有机溶剂沉淀法、凝胶层析法、离子交换法、亲和层析法、电泳亲和层析法原理：亲和层次法是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性载体上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。亲和层析法中，如何选择良好的配体：1.抗原或抗体必须具备单一独特性 2.抗原与抗体之间必须具有较强的亲和力 3.配体必须有一个适当的化学集团抗血清的获
11、得（动物采血法）：颈动脉放血法、心脏采血法、静脉多次采血法免疫血清的保存方法：1.4保存，三月至半年 2.低温保存，即 20-40保存，5 年 3.真空干燥保存，5-10 年可溶性抗原的制备和纯化：1.组织和细胞粗抗原的制备 2.可溶性抗原的纯化 3.免疫球蛋白片段的制备 4.纯化抗原的浓缩和保存 5.纯化抗原的鉴定免疫剂量的选择：合适剂量免疫原的选定应考虑抗原的种类、免疫的次数、注射的途径以及受体动物的种类、免疫周期和所要求的抗体特性HAT 培养基的组成与作用：由常用的细胞培养基加入次黄嘌呤（H） 、氨基蝶呤（A） 、胸腺嘧啶核苷（T）组成。其中 A 阻断细胞合成 DNA 的主要途径，H、T
12、 提供核苷酸合成的前体单克隆抗体制备流程：1.取得 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞 2.PEG 作用下融合成杂交瘤细胞3.HAT 选择培养 4.阳性克隆的筛选 B 克隆化（ELISA）5.克隆扩增 B 大量制备单克隆抗体B 淋巴细胞杂交瘤的骨髓瘤细胞特点：1.稳定、易培养 2.自身无分泌功能 3.融合率高4.HGPRT 缺陷B 淋巴细胞杂交瘤选择培养基的原理：融合细胞有 B 细胞与瘤细胞，瘤细胞与瘤细胞，未融合的细胞，这三类细胞在体外可长期生长。在培养基中加入次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸腺命定核苷。氨基蝶呤是叶酸拮抗剂，阻断 DNA 合成的主要途径，靠补偿途径合成 DNA，但选用的骨髓细胞是 HGPRT
13、缺陷株，不能利用次黄嘌呤，所以瘤细胞与瘤细胞融合细胞及单独瘤细胞亦不能生长，只有瘤细胞与 B 细胞融合细胞能正常生长，因为 B 细胞 HGPRT 阳性，通过补偿途径合成 DNA基因工程抗体的类型：1.人源化抗体 2.小分子抗体 3.抗体融合蛋白 4.双特异性抗体絮状沉淀试验：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了三种最适比例的基本测定方法抗体稀释法、抗原稀释法、方阵法（棋盘格法） 。该法多用于抗原抗体最适比测定 。沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在适合的条件下形成肉眼可见沉淀物的现象。:沉淀反应
14、分为液相沉淀试验、凝胶沉淀实验、免疫电泳试验和免疫浊度试验。凝胶内沉淀实验原理：可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。根据抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向免疫扩散试验和双向免疫扩散试验，最常用的凝胶为琼脂糖 。单向免疫扩散试验的应用评价：常用于 IgG，IgA，IgM，C3，C4 等血浆蛋白的定量测定。操作简单，无需特殊设备，重复性和线性可信，灵敏度差，耗时长，影响因素多。双向免疫扩散实验应用与评价：1. 抗原或抗体的定性分析 2. 抗体效价测定 3. 抗原或抗体相对分子量的分析 4. 抗原和抗体的纯度鉴定 5.抗原性质
15、分析 评价本法操作简单，不需要特殊设备，特异性高，结果可靠，成本低；但灵敏度低，耗时长免疫浊度测定的基本原理：是抗原、抗体在特殊缓冲液中反应而又比例合适（抗体过量）时，形成的小分子可溶性免疫复合物（19 S） ，使反应液出现浊度。在抗体过量且固定的条件下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增强，即待测抗原量与反应后溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，制备剂量-反应曲线，即求出标本中抗原含量。凝集反应的发生机制：分两阶段：抗原抗体的特异结合：抗体克服 Z 电位 出现可见的颗粒凝集：抗体搭桥使多个抗原分子聚集，形成肉眼可见的大分子。IgM 类抗体的作用比
16、IgG 类抗体要大数百倍，IgG 类抗体常出现不完全反应，即不可见的抗原抗体反应。不完全抗体：可与抗原牢固结合，但因其分子量较小，不能起到由桥联作用而形成的可见凝集现象。凝集反应的类型：直接、间接、特殊凝集反应直接凝集反应：玻片凝集试验 定性 细菌诊断、分型，ABO 血型鉴定 试管凝集试验 半定量 肥达实验、外斐试验 、交叉配血微量血凝反应板法间接凝集反常用载体:RBC（醛化） 、聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化） 、含有 A 蛋白的金黄色葡萄球菌（SPA ） 、活性炭、明胶颗粒。间接凝集抑制试验：诊断试剂:抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体（正向） 检测目标：标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。若出现载体颗粒游离现象，凝集反应被抑制，间接凝集抑制试验阳性。免疫印迹法：第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段：电转移；第三阶段：酶免疫定位免疫溶血反应：是红细胞-抗体复合物激活补体，导致红细胞溶解的反应。参与成分有：红细胞，一般是绵羊红细胞 SRBC、抗红细胞抗体，也称溶血素、补体免疫溶血反应的直接用途：是测
