重组人肿瘤坏死因子-α体内外对HL-60细胞作用的研究

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1、1重组人肿瘤坏死因子- 体内外对 HL-60 细胞作用的研究作者：刘霞，陈元仲，吴勇，黄美娟，杨大柳，郭江睿【摘要 】 为了研究重组人肿瘤坏死因子- （recombinant human tumor necrosis factor-alpha，rhTNF-）在体外及体内对人髓系白血病细胞株 HL-60 细胞的作用，应用 MTT 法和集落形成试验测定 HL-60 细胞的增殖抑制，采用 AO/EB 荧光染色法、流式细胞术和 TdT 酶介导的缺口末端标记（ TUNEL）法检测凋亡细胞；利用 HL-60 细胞裸鼠异种移植瘤模型观察给药后瘤体重量、组织病理的改变，并采用透射电镜以及 TUNEL 法检测瘤

2、组织细胞的凋亡。结果表明： rhTNF- 对 HL-60 细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈时间和浓度依赖性；AO/EB 染色后可见 rhTNF- 处理组 HL-60细胞核内染色质浓缩聚集或成碎片，呈现凋亡表象；流式细胞术显示随着 rhTNF- 浓度的增加，细胞凋亡阳性率逐渐增高；TUNEL法检测显示，3 200 U/ml rhTNF- 作用于 HL-60 细胞 48 小时凋亡阳性率可达 37.5%。在体内，rhTNF- 可抑制 HL-60 细胞裸鼠异种移植瘤生长，抑制率最高可达 60.33%；病理检查发现，rhTNF- 处理组的瘤组织有程度不等的出血坏死区域;透射电镜及TUNEL 法检测表明，

3、处理组的瘤组织可见有较多凋亡细胞。结论：2rhTNF- 在体内、外均可抑制 HL-60 细胞增殖，并诱导其凋亡。 【关键词】 重组人肿瘤坏死因子Effects of Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha on HL-60 Cells In Vitro and In VivoAbstract To study the effects of recombinant human tumor necrosis factor-alpha ( rhTNF-) on HL-60 cells in vitro and in vivo，MTT and col

4、ony forming assay were used to examine the effects of rhTNF- on proliferation of HL-60 cells; AO/EB (acridine orange - ethidium bromide) staining，Annexin -V flow cytometry analysis and TUNEL assay were used to detect apoptotic cells .The effect of rhTNF- on xenograft growth of HL-60 cells was evalua

5、ted by tumor inhibition rate，histology ，ultrastructure and TUNEL assay. The results showed that rhTNF- inhibited the proliferation of HL-60 cells in a dose-dependent manner. Staining of cells with AO/EB revealed that rhTNF- induced nuclear chromatin condensation and fragmentation . Positive Annexin

6、V -FITC on cell membrane showed that rhTNF- induced apoptosis of HL-60 cells in a dose-dependent 3manner. TUNEL assay showed that the apoptotic percentage of HL-60 cells reached 37.5% when incubated with 3200 U/ml rhTNF- for 48 hours. In vivo rhTNF- inhibited xenograft growth of HL-60 cells with the

7、 highest inhibition rate of 60.33%. Pathologically it was found that there were necrotic areas in the tumors of groups treated with rhTNF-. There were more apoptotic cells in treatment groups than in that control group by transmission electron microscopy (TEM) and TUNEL assay. It is concluded that r

8、hTNF- is able to inhibit the proliferation of HL-60 cells and to induce apoptosis of HL-60 cells in vitro and in vivo.Key words rhTNF-; HL-60 cells; Proliferation; Apoptosis肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-alpha，TNF-）是一种多效应的细胞因子，具有抗肿瘤、抗感染和调节机体免疫等功能，其抗肿瘤作用一直备受关注。有关 TNF- 的抗肿瘤作用侧重于对黑色素瘤、肺癌、肝癌、鼻咽癌、喉癌等，而对白血

9、病的作用研究较少。我们前期的研究发现，在三氧化二砷（As2O3）诱导 HL-60 细胞凋亡过程中伴有内源性 TNF- 表达增强，而 TNF- 反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸能够抑制 As2O3 诱导细胞凋亡1 ，提示内4源性 TNF- 在 HL-60 细胞凋亡过程中的起驱动作用。已知外源性TNF- 在体外可以诱导 HL-60 细胞凋亡2 ，而其在体内对 HL-60 细胞的作用，目前仍未见有报道。本实验采用重组人肿瘤坏死因子-（rhTNF- ） ，研究其在体外对 HL-60 细胞的作用，进一步通过 HL-60 细胞裸鼠移植瘤模型，研究其在体内对 HL-60 细胞裸鼠移植瘤的作用。材料和方法细胞培养人髓

10、系白血病细胞株 HL-60，由武汉中国典型培养物保藏中心引进。置于含 10%的胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所）的RPMI 1640（Gibco-BRL）培养液中，在 37、饱和湿度、5% 的CO2 培养箱中培养。药物和动物rhTNF- 由厦门特宝生物工程有限公司馈赠，1 mg 比活性不低于 2107 U，-20冰箱保存。6-8 周龄的 BABL/c 裸鼠，体重 16-18 克。由中国医学科学院上海实验动物繁育中心提供，为无特殊致病菌（SPF）动物，合格证号为 SCXX（沪）2003-0003 。裸5鼠在 SPF 层流柜中饲养。细胞活力的 MTT 法测定取 96 孔培养板若干，每孔接种 HL

11、-60 细胞 100 l（密度为1105/ml） ，然后加入用 RPMI 1640 培养液稀释的不同浓度的rhTNF-，使 rhTNF- 终浓度分别为 3 200、1 600、 800、 400、200、100 、50 、25 和 0 U/ml，每组设 4 个平行孔，分别培养 24、48、72 和 96 小时，按照徐承熊3 的方法进行检测。集落形成试验培养体系的总体积为 1 ml，其中含 10%胎牛血清、0.8%甲基纤维素的 RPMI 1640 培养液。实验组 rhTNF- 终浓度分别为100 、200 和 400 U/ml，对照组加 RPMI 1640，HL-60 细胞终浓度为 4102/m

12、l，种于 24 孔板，每组设 3 个平行孔。培养 7 天后，计数集落数目。大于或等于 20 个细胞组成的细胞群为 1 个白血病细胞集落。集落形成抑制率（%）=（1 实验组集落数/对照组集落数）100% 。细胞凋亡的检测6分别收集 800、1 600 和 3 200 U/ml rhTNF- 作用 48 小时后的 HL-60 细胞，采用 AO/EB 荧光染色法、流式细胞术（Annexin V-FITC 试剂盒，Becton Dickinson 公司） 、TdT 酶介导的缺口末端标记（TUNEL 试剂盒，Promega 公司）法检测细胞凋亡。详细方法根据相应试剂盒中的说明书进行。rhTNF- 对 H

13、L-60 荷瘤裸鼠体内抗白血病作用的测定收集对数生长期的 HL-60 细胞，在每只裸鼠右后背侧皮下接种 0.2 ml 细胞悬液（2.5106 个细胞 /只） ，选择肿瘤的直径为0.5-0.6 cm 的裸鼠随机分为高（ G1） 、中（ G2） 、低（G3）3 个浓度组和生理盐水对照（G0）组，每组 7 只裸鼠。高、中、低浓度组分别按每只每次瘤内注射 rhTNF- 2.0104 U/0.2 ml、1.0104 U/0.2 ml 、0.5104 U/0.2 ml 进行治疗，对照组注射等量生理盐水。每天给药 1 次，连续 7 天。末次给药后 24 小时，取出实验裸鼠，颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块称重，计

14、算抑瘤率并行 HE 染色作病理检查。抑瘤率（%）=(1实验组平均瘤重/对照组平均瘤重) 100%。采用透射电镜观察瘤组织超微结构、用 TUNEL 法检测瘤组织中细胞凋亡。统计学分析7采用 SPSS 11.5 for windows 软件包进行单因素方差分析。结果rhTNF- 对 HL-60 细胞增殖的抑制作用不同浓度 rhTNF- 及不同处理时间对 HL-60 细胞增殖均有明显抑制作用，且呈时间、浓度依赖关系（图 1） 。rhTNF- 对 HL-60 细胞集落形成亦具有明显抑制作用（表 1） 。Table 1. Effects of rhTNF- on the colony forming o

15、f HL-60 cells（略）rhTNF- 诱导 HL-60 细胞凋亡的作用AO/EB 复合染色结果显示：HL-60 细胞经 rhTNF- 处理 48小时，细胞大小、形态呈不均一性，可见凋亡细胞，胞核或胞浆呈致密浓染或碎片黄绿色荧光，同时偶见坏死细胞，胞核呈红色荧光（图 2） 。流式细胞仪检测发现， rhTNF- 能诱导 HL-60 细胞凋亡，并呈浓度依赖性（表 2） 。TUNEL 法检测发现 rhTNF- 800、1 600 和 3 200 U/ml 分别作用 HL-60 细胞 48 小时，各组凋亡阳性率依次为 15.0% 、22.5%、37.5%，而对照组 HL-60 细胞均未见或偶见阳

16、性细胞（图 3） 。Table 2. Rate of apoptosis in rhTNF- treated HL-60 cells by Annexin V-FITC and PI staining (略 )8rhTNF- 对 HL-60 细胞裸鼠移植瘤的作用rhTNF- 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用对 HL-60 细胞裸鼠移植瘤行瘤内注射 rhTNF-，瘤内注射rhTNF- 1.0104 单位/只和 2.0104 单位/只时，其对移植瘤的抑制率分别为 55.21%（P0.05）和 60.33%（P0.01） 。但采用低浓度（0.5104 单位/只）时，其对移植瘤的抑制率仅为17.36%（P0.05） 。此结果说明实验中的高、中浓度 rhTNF- 对HL-60 细胞株裸鼠异种移植瘤的生长具有抑制作用。各组给药后瘤体大小、重量详见表 3 及图 4。Table