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1、实验一、真核生物基因组DNA的提取、电泳,掌握Southern blot的原理及基本步骤掌握人外周血基因组模板DNA的提取技术。 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。,第一部分 ：裂解红细胞、蛋白酶k消化第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀基因组DNA第三部分： 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳第四部分： 基因组DNA变性，中和及转膜,二、实验内容,三、主要试剂（稍后讲解）,一、 实验目的,四、实验步骤（马上讲解）,1）取0.3ml抗凝血置于1.5ml Eppendorf管中.2）加入1ml STMT 溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。3）9,000rpm,离心 3 分钟(统一离心)。4） 弃上
2、清。弹管底重悬沉淀。,实验第一部分 裂解红细胞、蛋白酶K消化,注意事项：离心时离心机内样品平衡后对称放置加样器加样准确。,4）加 0.4ml生理盐水，悬浮细胞。5） 9000rpm,离心 3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。,6）加460 l NE溶液，混匀。7）加30 l 10%SDS, 迅速混匀。8）加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀， 置50C水浴1小时。,操作注意事项： 1、混匀时确认沉淀已被悬起。 2、注意30ul、50ul加样体积准确。,实验第一部分 裂解红细胞、蛋白酶K消化,核酸提取的主要步骤,课间介绍,真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1) 破碎细胞2) 去除蛋
3、白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA3) 沉淀核酸,乙醇沉淀,SDS裂解蛋白酶K消化,琼脂糖电泳,PCR,DNA提取步骤图解,酚氯仿抽提,二、各种试剂的作用,成分：S: Sugar 8% T: Triton X-100 1% M: MgCl2 0.5mM T: Tris-HCl 10mM (PH:8.0) 作用： 用Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。 从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。 （而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。,1、STMT 溶液
4、：,作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用,成分：N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性 (螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。,二、各种试剂的作用,2、NE 溶液：,3、SDS ：十二烷基硫酸钠 终浓度0.5%,4、蛋白酶K(或链霉蛋白酶),作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,重蒸酚: 酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。 无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色) 破坏磷
5、酸二脂键。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。 在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉： 0.1% 黄色酚相指示剂 抗氧化剂,作用： 去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。,5、TE饱和重蒸苯酚：,成分：,氯仿作用： a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖
6、、抑制核酸酶活性；,6、酚/氯仿,7、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1),氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。,在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。,9、无水乙醇 ：,作用：提供单价阳离子。,8、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.2,核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等,1、加入580ul(等体积)TE饱和酚, 混匀1min. 100
7、00rpm,2min。 (注意抽取下层酚相; 轻柔混匀，避免DNA链断裂;),实验第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀,5、加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml）混匀后置-70 沉淀10min。,4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。,3、 将上层水相移至一新管中。加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。,2、将上层水相移至一新管中，加入500ul(等体积)酚/氯仿， 同上条件混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。,注意事项：1） 本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。；2）
8、 在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。3）基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。,一定要充分溶解沉淀,7、加入10 l双蒸水，溶解沉淀，进行酶切电泳。,6、10,000 r/min离心5min， 吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体(勿触及DNA沉淀)， 37孵箱干燥至沉淀变透明。,蓝头,黄头,滤纸条,(吸干内壁液体),观察DNA沉淀的颜色。,实验第三部分、基因组DNA的酶切,基因组DNA的酶切： 基因组DNA 8 ul 10x Buffer H 1 ul Eco
9、R I(最后加入) 0.6 ul 置 37 保温 45 min。,酶切相关知识,1、酶活性单位 Unit （U）： 1U: 是指在1小时内，适当温度下(37C)，在50ul 反应体系中，将1ug of lambda DNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。 2、酶切体系： 10反应缓冲液：提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。 双蒸水：无细菌和其他酶类污染。 BSA ：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。 内切酶：含50%甘油，-20保存。 反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应5%。,1. Southern blot DNA水平基因结构分析的重要策略之一. 基因
10、组DNA酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。 2.构建基因组文库3.PCR的模板克隆表达基因 分析基因一级结构的变化基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性；利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。,提取模板DNA的常见目的,实验第四部分、基因组DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定,一、琼脂糖凝胶电泳原理,DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子
11、量较小的DNA片段跑在前面。,二、 琼脂糖凝胶电泳实验操作,制备琼脂糖凝胶电泳（1%） 实验老师准备,2. 上样：在样品中加 23ul 6上样液，混匀，将样品缓慢加入上样孔内,三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂,上样液成份： 10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重利于加样）电泳缓冲液： TAE 为例 T: Tris碱 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定缓冲能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 溴化乙锭（EB）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。,致癌
12、剂,线性DNA片断大小（kb） 琼脂糖浓度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,思考： 凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？,四、 琼脂糖凝胶的浓度,五、 电泳仪的使用方法,稳压: 电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。 如箭头所示。,六、预期结果,用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现连续的、弥漫云雾状带，称 Smear 带。 识别 6bp序列的内切酶，平均每4096 bp长度出现一次切割概率。,如果Smear带密度比较均匀，说明酶切效果比较好，可用于Southern Blot 实验。,1 2 3 4 5,Marker,总DNA,未酶切的基因组,思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? 蛋白酶K, SDS, TE 饱和酚，氯仿, 乙醇, EDTA2. DNA提取过程中有哪些注意事项？,实验结束后整理实验台, 值日生值日!,
