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1、脑缺血诱导了大鼠皮层和海马二价金属离子转运体 1 表达增加李艳伟 1 赵晋英 1 黄俊 1 李琳 2 （1 湖南省邵阳医学高等专科学校解剖学教研室 湖南邵阳 4220002 山西医科大学教育部省部共建细胞生理学实验室，山西太原 030001）【摘要】目的 探讨脑缺血对大鼠皮层、海马二价金属离子转运体 1（DMT1）表达的影响。方法 雄性 Wistar 大鼠随机分为脑缺血 1d、3d、 7d、 28d 和假手术组。经结扎双侧颈总动脉造脑缺血模型组，假手术组仅分离双侧颈总动脉但不结扎。 采用 RT-PCR 测定DMT1+/-IRE mRNA 的表达； 采用免疫组化染色测定大鼠皮层及海马组织 DMT
2、1 表达。结果 大鼠皮层和海马 DMT1+/-IRE mRNA 的表达随缺血的延长逐渐增加。与假手术组比较，皮层 DMT1+/-IRE mRNA 的表达在缺血 1d、3d 时无差异（ P0.05）；缺血 7d 时表达增加（P 0.05），其余海马 DMT1+/-IRE mRNA 表达均高于假手术组（P 0.05），其余各组均高于假手术组(P0.05）, but not in rats suffering from cerebral ischemia for 1 day（P0.05）. Conclusion In the cortex and hippocampus of rats, cereb
3、ral ischemia induced an increase of the expression of DMT1, which may involve in the mechanism of increase of iron concentration and abundant iron deposition in neuron by induced cerebral ischemia. 【Keywords】cerebral ischemia; brain iron concentration; divalent metal transporter-1研究表明脑缺血时脑铁代谢改变主要表现为
4、脑铁含量升高 1，而降低机体铁含量，尤其是降低脑铁水平可以减轻脑缺血损伤 2,3。但脑缺血引起脑铁含量增多的原因至今未明。二价金属离子转运体 1（divalent metal transporter-1，DMT1）作为一种跨膜铁转运蛋白，存在于多种组织，在细胞铁吸收过程中起重要作用 4,5。Williams 等研究发现 DMT1 mRNA广泛存在于纹状体、皮层、海马和小脑 6；Moos 等 7发现 DMT1 参与了神经元的铁摄入；Burdo 等 8认为 Belgrade 大鼠脑内低铁与 DMT1 基因突变有关。这些研究充分说明 DMT1在脑组织铁摄入中起重要的作用。那么脑缺血诱导的脑铁沉积是否
5、与 DMT1 异常有关目前尚未见报道。因此，本实验经结扎大鼠双侧颈总动脉建立脑缺血模型，通过检测大鼠皮层和海马 DMT1 的表达，探讨缺血对脑组织 DMT1 表达的影响，及其在脑缺血引起脑铁失衡中的作用。1 材料和方法 1.1 实验动物及处理雄性 Wistar 大鼠，250-300g，随机分为脑缺血 1d、3d、7d、28d 和假手术对照组，每组各 12 只。手术参照 wakita 等 9的方法，大鼠术前 12 小时禁饮食，水合氯醛（350mg/kg）经腹腔麻醉，实验组用丝线结扎双侧颈总动脉，对照组仅分离出双侧颈总动脉但不结扎。每组 6 只实验动物经生理盐水和 4%多聚甲醛磷酸盐冷溶液快速灌注
6、固定，取脑固定，石蜡包埋切片（4m 厚），每隔 10 张切片取连续 3 张分别进行免疫组化染色。其余动物取新鲜皮层和海马进行 RT-PCR 实验。1.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） Trizol试剂（上海生物工程有限公司）提取脑组织总RNA，并测定吸光度A260/A280比值。RT-PCR反应使用 Takara RT-PCR两步法试剂盒(大连宝生物工程有限公司 )，引物序列如下（大连宝生物工程有限公司）：大鼠 DMT1+IRE（AF008439） 10上游序列： 5-CGG TAA GCA TCT CTA AAG-3，下游序列：5-TAG CAG CAT GCT ATT TGA C-
7、3，扩增长度为267bp；大鼠 DMT1-IRE（AF029757） 10上游序列： 5-TCT AGA TGA CCA ACA GCC-3，下游序列：5-GCA GAC ACA AGC CTG CGT-3，扩增长度为264bp。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH (NM_017008)为内参照，上游序列： 5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3，下游序列：5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3，扩增长度308bp。PCR 仪（AG22331，德国Eppendorf公司)设定条件：第一步94 2 min，1个循环；第二步，94 30 s，56 30s
8、 (50 for GAPDH)，72 1 min，30个循环。扩增结束后，取5ul扩增产物加2ul上样缓冲液，混匀后点于 1.5%琼脂糖凝胶孔，电压100V，电泳1小时左右，在紫外灯下观察并摄像。采用Photoshop软件进行亮度测定，将扩增产物与内参照亮度相比得出相对定量。1.3 免疫组化染色 采用免疫组化 SP 法检测 DMT1 表达。一抗为兔抗鼠 DMT1 抗体（ADI 公司，1:500 ），兔 SP 检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，操作严格按照试剂说明书进行，用 PBS 代替一抗作阴性对照。结果判断：DMT1 定位于胞膜和胞浆内，含棕黄色颗粒为阳性细胞，镜检随机选取 10 个视野，
9、用显微图像分析软件 Image-pro plus 6.0 测定阳性目标的平均灰度值、视场平均灰度值、面积密度，并按文献方法 11换算成阳性单位(Positive unit，PU) ，以 PU 值大小代表阳性产物表达的多少。1.4 统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件包进行统计分析。数据以 s 表示，组间比较用xANOVA 方差分析，P0.05）；在缺血 7d 时表达增加（P0.05）外，其余各组DMT1+/-IRE mRNA 表达均高于对照组（P0.05），缺血 3d 组皮层DMT1 表达增加了 28.43%(P0.05)，海马增加了 19.32%(P0.05)；缺血 7d 组皮层 D
10、MT1 表达增加了 71.15%(P0.01)，海马增加了 79.93%(P0.01)；缺血 28d 组皮层 DMT1 表达增加了 101.22%(P0.01)，海马增加了 97.88%(P0.01)。（Fig 45） Fig 4: The expression of DMT1 by immunohistochemistry. Picture A and B showed the hippocampus of control rats and cerebral ischemic rats at the 28th day, respectivly. Picture C and D showed
11、the cortex of control rats and cerebral ischemic rats at the 28th day, respectivly. Bar=25mFig 5: The expression of DMT1 of the cortex and hippocampus in rats（PU）by immunohistochemistry.（as compared with sham group, * P0.05; * P0.01）4 讨论DMT1 是新近发现的一种高度疏水的跨膜铁转运蛋白，由 12 个跨膜区域组成，在人体组织内分布十分广泛，在小肠近端表达最高 1
12、2。DMT1 在转铁蛋白 -转铁蛋白受体 (transferrin- transferrin receptor, TfTfR)细胞摄铁途径中发挥重要作用：转铁蛋白铁与 TfR结合形成内吞小体，内吞小体的酸化环境使 Fe3 从 Tf 上释放，并转变为 Fe2 ，Fe 2 再由内吞小体膜上的 DMT1 介导释放入胞浆中 13。Fleming 等 5发现 DMT1 基因突变的Belgrade 鼠通过 Tf-TfR 吸收的铁，虽然能进入内吞小体，但却无法进入胞浆，也支持上述观点。DMT1 在脑铁代谢中也有重要作用 12。Burdo 等发现， DMT1 在脑内呈区域及细胞特异性分布：在纹状体的星形胶质细
13、胞及血管内皮细胞、下丘脑的神经元、小脑的蒲肯野细胞及室管膜细胞表达较高，另外，DMT1 也存在于大脑灰质各层、侧中隔核、海马及乳头状核 8。DMT1 在脑血管内皮细胞与室管膜细胞高表达与 TfR 的分布几乎完全重叠，这表明 DMT1 在脑组织摄取铁的 TfTfR 途径中也参与了内吞小体释放铁的过程。 Moos 等发现 DMT1 在神经元铁摄入中发挥作用 7，Belgrade 大鼠 DMT1 突变影响了神经元的铁摄入 14。 Chang15等发现左旋多巴胺的神经毒性及 Jiang16等用甲基苯基四氢吡啶处理C57BL/6J 小鼠引起的黑质铁增加均可能与 DMT1 mRNA 表达增多，从而导致神经
14、元铁摄入过多有关。另外，Wang 17等在研究猴大脑新皮质和海马DMT1 的分布情况时，发现 DMT1存在于皮层、皮层下白质和海马的神经胶质细胞，DMT1 不仅在胶质细胞胞体上有表达，而且在围绕皮质和皮质下血管的胶质细胞终足上有高度表达。显示出DMT1在胶质细胞从血管内皮细胞获取铁的过程中作用重大，换句话说DMT1 可能在铁跨越血脑屏障过程中意义重大。研究发现注射红藻氨酸盐可引起大鼠海马铁沉积，Western 证实伴有DMT1的表达增高；免疫细胞化学发现，DMT1表达于海马星形胶质细胞上；通过电镜进一步证实DMT1 位于星形胶质细胞围绕血管的终足上 18-21。这些结果显示出红藻氨酸盐引起海马
15、铁沉积与星形胶质细胞DMT1表达增高，进而导致跨越血脑屏障的铁吸收增多有关。一种含有铁效应元件（iron response element, IRE）的 DMT1 mRNA，称为“IRE” ，另一种不含 IRE，称为“IRE” 。IRE 结构介导铁水平调控的 DMT1 mRNA 稳定性 13。用 PC12 细胞研究发现 DMT1IRE 主要分布在细胞表面、轴突及含 Tf 和游离铁的内吞小体上， DMT1IRE 主要分布在细胞核，这表明 DMT1IRE 可能主要发挥细胞摄铁及胞内铁转运的作用，而 DMT1 IRE 则可能起俘获并转运二价金属进入细胞核，并保持核内金属离子稳定性 10。综上所述，D
16、MT1 可表达于大脑皮层及海马的神经元和神经胶质细胞中，在神经元的铁摄入和血脑屏障的铁转运过程中发挥着重要作用。几种毒性物质导致的大脑区域性铁沉积与 DMT1 的表达增多有关。那么我们前期研究发现的脑缺血引起的神经元铁沉积和大脑铁含量的增加是否与 DMT1 表达改变有关，尚未见报道。基于此我们在本实验中初步探讨了脑缺血后 DMT1 的表达情况。本实验中 RT-PCR 结果显示，与对照组相比，大鼠皮层 DMT1+/-IRE mRNA 在缺血1、3d 组的表达无差异；在缺血 7、28d 时均明显增加。在海马，除缺血 1d 组 DMT1-IRE mRNA 的表达与对照组无差异外，其余各组 DMT1+/-IRE mRNA 的表达均高于假手术组。显示出脑缺血后，大鼠皮层及海马 DMT1 两种形式的 mRNA 均发生了变化，脑缺血时DMT1 mR
