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1、实验二 普通光学显微镜的使用,一、目的要求,1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。2、学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。,二、基本原理,现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成（图2-1）。,1.镜座；2.载物台；3.镜臂；4.棱镜套；5.镜筒；6.接目镜；7.转换器；8.接物镜；9.聚光器；10.虹彩光圈；11.光圈固定器；12.聚光器升降螺旋；13.反光镜；14.细调节器；15.粗调节器；16.标本夹,在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜配置的几种物镜中
2、，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要又有如下两方面的原因：,1、增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大（图2-2）。,从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时需在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（n =1.55）相仿的镜油（通常使用香柏油，其折射率n =1.52）。,2、增加显
3、微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力（resolution or resolving power）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：,式中：=光波波长，NA=物镜的数值孔径值。,光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.40.7 m），而数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=nsin 。 式中为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.3
4、3）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径（NA一般在1.21.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55m来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨距离不小于0.4m的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2 m左右。,三、实验器材,1、菌种 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和四联球菌染色玻片标本。2、溶液或试剂 香柏油、1:3酒精乙醚混合液。3、仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸。,四、实验步骤,1、观察前的准备（1） 显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约34。镜检时姿势要端正。 取、放显微镜时应一手
5、握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。（2） 光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。,（3） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。（4） 聚光器数值孔径值的调节 调节聚光器虹彩光圈值与
6、物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看视野，一边缩光圈，调节光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应该进行这种调节。,在聚光器的数值孔径确定后，若需要改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度和照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。,2、显微观察 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数
7、的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵从由低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。,（1） 低倍镜观察 将染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10 物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录观察到的结果。 在任何时候使用粗调节器聚焦物象时，必须养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行
8、准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。,（2） 高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物象将保持基本聚焦的状态，这种现象称为物镜的同焦（parfocal）。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。,
9、（3） 油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在油镜中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能由于油镜头下降还没有到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头
10、时用力过猛，或聚焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。,3、显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下载玻片。（2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许酒精乙醚混合液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用稠布清洁显微镜的金属部件。（4） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“ 八 ”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。,分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及四连球菌的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。,五、实验结果,（1） 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？（2） 试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？（3） 影响显微镜分辨率的因素有哪些？（4） 根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物大小，选择不同的物镜进行有效的观察。,思考题,
