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1、,Partec - Excellence in Flow Cytometry,Contributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology德国Partec公司中国服务中心张向阳,超过41年的研发经验,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞仪的原理流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞术,流式细胞分析，又称流式细胞术（flow cytometry，FC
2、M），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞术,流式细胞分析，又称流式细胞术（flow cytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物
3、理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,特点：（1）单细胞分析。（2）快速分析。（3）多参数相关测量。（4）定性或定量分析细胞。（5）统计学意义明显。 （6）分选。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,荧 光,有些物质，当用光照射时，它吸收了该种波长的光后还会发射出各种颜色和不同强度的光，而当光停止照射后，这
4、种发射的光也随之消失，这种发射的光称为荧光(fluorescence)。荧光的波长比吸收光线的波长要长些。由于物质的分子结构不同，所吸收的光和所发射的荧光波长也不同。被这些物质吸收的光称为激发光，产生的发射光即荧光。荧光的颜色多为红、蓝、绿或黄等。物质的荧光有两种，一种是自发性荧光，即组织在短波长光照射下自行发射出的荧光。如，组织中的蛋白质和脂类在紫外线照射下能发射出微弱的淡蓝色荧光。另一种荧光是诱发荧光，即细胞与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光。常用的是诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称为荧光染料(或称荧光色素)。,Partec - Excellence in Flow Cy
5、tometry,超过41年的研发经验,荧光激发与发射原理,能量级,能量损失,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,免疫荧光技术,免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞表面或细胞内的相应抗原(或抗体)。从而使形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用流式细胞仪检测标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(如，黄、绿色或红色等)，通过确定抗原或抗体的性质、定位来推断细胞的信息，以及利用定量技术测定含量。,常用方法：单抗直接标记,Part
6、ec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,嵌入性染料,如DAPI、赫斯特、PI等，直接与细胞内的DNA双螺旋结构中的A-T碱基对结合，从而使细胞在激发光的照射下发特定波长的光，通过判断发射光的强弱来推算A-T碱基对的多少，从而得知DNA的倍性关系。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,细胞膜电位、离子、脂类探针,现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些意想不到的效果。详细信息，见细胞探针公司网站： ww
7、w.molecularP,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,与流式细胞仪相关的荧光术语,MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在600MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：200MESF以内,Partec - Excellence in Flow Cyt
8、ometry,超过41年的研发经验,常见荧光染料列表,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,常见荧光染料列表,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,常用荧光染料种类,488nm蓝色激光激发： FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PE-Cy5（PE的衍生物）：红色 665nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：红色675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm637nm红色激光激发： APC(别藻兰蛋白）：红色 665nm A
9、PC-Cy5(别藻兰蛋白的衍生物）：深红色 710nm365nm紫外光激发： DAPI（4，6-咪基-2联苯吲哚）：蓝色 455nm532nm绿色激光激发： PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PE-Dy647 （PE的衍生物）：红色 647nm PE-Cy5（PE的衍生物）：红色 665nm,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞仪的原理概述,流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一种自动分析细胞的高端技术设备，其原理是悬浮在液体中的细胞一个个地依次通过测量区，当每个细胞通过测量区并被激发光照射时产生光信
10、号，然后被光电倍增管（PMT）转化成电信号，这些信号可以代表荧光、普通光散射、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞仪的原理工作原理,待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷
11、出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统（透镜、光阑，滤片和检测器等）用以收集荧光信号。光电倍增管将收集的光信号转化为电信号再传输至计算机，计算机通过相应的软件将电信号模拟成图像。,流动室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为350250um的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢,因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的
12、检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动的液体，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，结合样品喷嘴的特殊结构，从而保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞信息（散射光和荧光）。,超过41年的研发经验,激光，如：488nm,FL2 PE,SSC,FSC,液路,电子元件部分,计算机,FL3 PerCP, Cy5,FL1 FITC,光学接收器,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,流式细胞仪的构造,流动室及液流
13、驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统（滤光片组）信号检测与存储系统显示、分析系统,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,激 光,提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此要求细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约即短轴稍大于细胞的直径的光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布;为保证样品中细胞是一个一个分别
14、受到光照并且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处,台式机FCM的光路调节对用户是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后,无需用户作任何调节, 所以用户操作十分方便。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,光学系统,流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在流式细胞仪的光学系统中主要光学原件是滤光片，主要分为三类：,长通滤片 LP短通滤片 SP带通滤片 BP,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的
15、研发经验,长通滤片,长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500 nm以上的光通过，而500 nm以下的光吸收或返回。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,短通滤片,与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,带通滤片,带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如BP 500 / 50表示其允许通过波长范围为475nm525nm。,Partec - Excellence in Flow Cytometry,超过41年的研发经验,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号, 下图是以激发光光源波长488nm为例的示意图：,
