《肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究【摘要】目的探讨肾综合征出血热(HFRS)的发病机理。方法23 天的近交系 Balb/C 乳鼠，脑内接种早期 HFRS 重症患者软腭粘膜出血点组织悬液，用套式聚合酶链式反应检测乳鼠脑、肺及肾组织中的 HFRS 病毒 RNA。结果接种乳鼠发病死亡，剖检显示，发病乳鼠各器官呈现明显微血管系统和实质组织病变，乳鼠脑、肺及肾组织中 HFRS 病毒 RNA 阳性。结论早期 HFRS 患者软腭粘膜出血点组织中含有 HFRS 病毒。 【Abstract】 ObjectiveTo expiore the pathogenic mechanism of hemorr
2、hagic fever with renal syndrome(HFRS).Methods2-3 days old inbred Balb/C suckling mice were inoculated intracerebrally with tissue suspension of soft parate petechia of HFRS patients and the HFRS virus RNA was tested in brain, lung and kidney tissues of sucking mice by nested PCR.ResultsSome of the m
3、ice developed acute disease and died. The autopsy analysis 2indicated that these mice showed pathological changes in system microvascular and parenchymatous tissues. HFRS virus RNA was detected in their brains, lungs and kidney tissues.ConclusionsThese results indicate that HFRS virus exists in the
4、tissue of petechial hemorrlngic spots on soft palate petechia of HFRS patients. 【Key words】Suckling mouseHemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS)Soft palatePetechiaPolymerase chain reacti on 肾综合征出血热(HFRS) 是一种由肾综合征出血的热病毒(HFRSV)引起的以几种鼠类为宿主的严重传染病1 。我们曾报道了一组经血清学证实的 HFRS 患者，在临床上软腭粘膜均有大小不等的出血点并以此作为临床早期
5、诊断的指标2，3 。应用电镜技术在数例患者软腭粘膜组织中找到了病毒颗粒，胶体金检测亦呈现阳性结果4，5 。此发现首次证实了口腔软腭磷状上皮细胞属HFRSV 侵袭的靶细胞。1982 年 Tsai 等报道经乳鼠脑内接种HFRSV 可致其发病死亡，这种乳鼠模型沿用到今6 。常规的乳鼠模型都是用 HFRS 病毒株使其致病，直接用出血热患者软腭粘膜组3织制成悬液对乳鼠作脑内注射，目前尚未见报道。为了进一步探讨肾综合征出血热患者口腔软腭出血的发病机理及确证 HFRSV 的新定位，我们采取 HFRS 患者软腭出血点组织对乳鼠直接进行脑内接种，观察其对乳鼠的致病性。 1材料和方法 1.1 组织取材 临床上确诊
6、为 HFRS 的早期住院患者。临床分型：重型 1 例，中型 2 例(按 1986 年南京 EHF 学术会议标准) 。患者的软腭均有独特的出血点于出血点处常规消毒，持活检钳夹取大小约 1 mm1 mm1 mm 粘膜组织数块，置于 200 目钢网上研磨。加入常规量青霉素，10%小牛血清，Eagle 氏液(pH7.4)，混匀制成 10%悬液，2 0003 000 r/min 离心 1520 min，取上清，液氮存放待检。取材局部粘膜用 10%硝酸银烧灼止血，生理盐水涂洗 23 遍，观察片刻无出血倾向即可。 1.2 实验动物及分组 23 天体重为 1.551.65 g 的 Balb/C 乳鼠 50 只
7、(河南医科大学动物实验中心提供 )。分为 5 组，每组 10 只，第 1 组乳鼠脑内注射 0.02 ml 生理盐水；第 2 组乳鼠4脑内接种 0.02 ml 重型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液；第 3、4 组乳鼠脑内接种 0.02 ml 中型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液；第 5 组乳鼠脑内直接注射 0.02 ml A16 株 HFRS 病毒悬液；实验组及对照组乳鼠均由母鼠喂养，逐日观察发病情况。 1.3 RNA 的提取 实验组及对照组乳鼠的脑、肺及肾组织各 30 mg，PBS 缓冲液冲洗后加入 1 mlGIT 缓冲液进行匀浆。用蛋白酶 K-SDS 液消化(蛋白酶 K， 100 g/ml;
8、SDS, 0.5%)37温育30 分钟。采用酚-氯仿法提取 RNA7 。 1.4 套式聚合酶链式反应 (Nested-PCR)Nested-PCR 试剂盒购于第四军医大学基因诊断技术应用研究所。第 1 对引物：(1)5-GAGATGATCATCAGGTTCAA-3，(2)5-GTGATAACATGGATCCTGAG-3；第 2 对引物：(1)5-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT-3，(2)5-AAGCTTTAGTAGTAGACTCC-3。利用该引物对可特异性地扩增出位于 HFRSV 高度保守区序列的 430 bp 的基因条带。第 1 次扩增：反应体系为 50 l, 其中含有 20
9、 mmol/L RNA 抽提液，0.5 mol/L第 1 对引物，40 U 的 RNase,5.6 U 鸟成骨髓瘤病毒逆转录酶，10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),1.5 mmol/L MgCl2,0.01%明胶，200 5mol/L dNTP;反应程序：94热启动 60 s，随后 94 变性 35 s，55退炎 45 s，72 延伸 50 s，循环 36 次，最后一次循环的延伸时间为 200 s。第 2 次扩增：含 5 l 第 1 次 PCR 产物，0.5 mol/L 第 2 对引物，其他条件同第一次。反应结束后取 10 l 扩增产物进行 2.0%的琼脂糖凝胶电泳(5-7V/
10、cm，20 min)。在紫外灯下观察结果，根据 DNA 分子量标准鉴定扩增产物的大小。 2结果 2.1 感染乳鼠的临床表现及发病情况分析乳鼠多在接 种后 69 天发病：背部弓起，行动迟缓，体重不增或增长迟缓，精神萎靡，卷缩和昏迷。继而两侧后肢僵直，终至死亡。剖检乳鼠可见其胸腔内有少量积液，两肺充血或见斑块状出血灶，肝、肾及脑膜血管充血，各脏器之间有轻度粘连。第 1 组注射重型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠及第 5 组阳性对照组全部发病死亡。另外两组注射中型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠及阴性对照组未见异常。结果表明 HFRS 患者口腔软腭粘膜出血点组织对乳鼠具有一定程度的致病性
11、。 2.2 套式-PCR 对发病乳鼠脏器组织的检测分析实验组及6对照组各脏器组织的 PCR 检测结果，从第 2 组注射重型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液乳鼠的脑、肺、肾组织及第 5 组阳性对照肾组织中均扩增出大小为 430 bp 的目的基因条带，而阴性对照组及注射中型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠脏器组织呈现阴性结果。3讨论 业已知道，HFRS 病毒在机体内的靶细胞具有显著的广泛性。我们经过多年的临床实践与基础研究发现：HFRS 患者软腭粘膜出血点阳性率为 100%，并在 3 例重型 HFRS 患者软腭出血点处找到了病毒颗粒，从而证实口腔软腭磷状上皮细胞属 EHF 侵袭的靶细胞4 。
12、 HFRS 病毒作脑内接种，对乳鼠具有高度的致病性 6 。本实验采用 1 例重型，2 例中型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液对乳鼠作脑内注射，结果重型组乳鼠全部发病死亡，并且剖检显示各器官呈现明显微血管系统和实质组织的病变，进一步用套式 PCR 对乳鼠脑、肺及肾组织悬液进行了检测，扩增出目的基因条带，从而再一次证实了口腔软腭粘膜鳞状上皮细胞是 HFRS 病毒侵袭的靶细胞，7为王素琴等3关于 HFRS 临床早期诊断指标的观点提供了进一步的依据；中型 HFRS 患者软腭粘膜组织悬液对乳鼠没有致病性，套式 PCR 检测亦示阴性结果，该现象的作用机制尚不清楚，目前正在探索中。 参考文献 1黄祯祥，主编
13、. 医学病毒学基础与实验技术. 北京：科学出版社，1990，532-584. 2王素琴，陈统文，封玫. 流行性出血热早期诊断指标探讨.中原医刊，1986，6 ：21. 3王素琴，封玫，杨莉，等. 口腔软腭出血点及血小板锐减对流行性出血热早期诊断的价值.中华传染病杂志，1995，13(1) ：53-54. 84王素琴，封玫，杨莉，等. 流行性出血热早期患者口腔软腭粘膜出血点和感染病毒的电镜研究.中华病理学杂志，1994，23(6)：361-363. 5王素琴，封玫，杨莉，等. 人口腔粘膜内流行性出血热病毒的胶体金电镜观察.军医进修学院学报，1994，15(1) ：27-29. 6Tsai T F, Bauer S, McCormick J B. Intracerebral inoculation of suckling mice with Hantan virus. Lancet, 1982,11:503-504. 7Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,343.
