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1、1肝细胞移植的临床应用【摘要】 50 多年前 Sorrentino 第一次用机械的方法把新鲜肝组织制成匀浆，并在体外进行药物实验，开创了肝脏功能的体外人工支持时代。Berry 和 Friend 等在 1969 年用自己配置成的消化液进行大鼠肝灌注第一次完整分离肝细胞。几十年来，肝细胞的分离培养及保存技术不断优化并为相关的肝脏研究和肝脏疾病的治疗提供了极为宝贵的途径。尤其是近年来肝细胞移植的实验和临床应用不断取得进展，为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景。优化和完善肝细胞的分离，培养和保存，仍然是关系到肝细胞移植效果的前提。近年来，不少的研究者正致力于临床的应用研究。根据所收集到的文献报道，世界各大
2、医学中心目前已有近 80 例肝细胞移植的临床应用，其结果令人鼓舞。可以预测，肝细胞移植作为整体器官移植的“桥梁”或替代治疗，将给众多肝病患者带来福音。本文就近年来肝细胞移植的临床应用研究进展作一综述。 【关键词】 肝细胞 分离 细胞培养 移植 临床应用肝脏是机体最重要的器官之一，在生理和病理状态下，它是能量代谢、解毒以及血浆蛋白合成的中心。当发生急性肝功能衰竭时，只有 15%25%的病人得以生存1 。许多慢性肝脏疾病如肝硬化、2肝癌等也最终导致肝脏功能的衰竭。长期以来，国内外学者注重于肝器官移植的研究, 因为肝移植疗效显著，1 年存活率可达 70%以上。但肝移植对技术条件、适应证及组织相容性等
3、要求较高, 加之肝供体的短缺，使肝移植的临床应用严重受限。因此，临床上急需其他方法，作为“桥梁”来缓解和改善肝功能，延长患者的生存时间，而等待肝移植，甚至取代肝移植。由此，肝细胞移植及生物人工肝的研究成为热点2,3 。不管是肝细胞移植或生物人工肝，肝细胞的分离、培养和保存是肝细胞临床应用的基石。就肝细胞分离培养和保存尤其是肝细胞移植的临床应用研究进展现综述如下。1 肝细胞分离培养与保存1.1 肝细胞的来源11.1 人肝细胞 人类肝脏细胞是最好的供体，因为肝脏细胞分化较高，有较好的合成和代谢功能4 ，因此肝细胞移植首选人肝细胞。但由于供体的严重短缺，目前用于肝细胞移植的供体多为不适于肝移植供体（
4、untransplantable liver） ，如脂肪肝、纤维化肝、受外伤肝等，这些细胞体外培养增殖困难，肝细胞功能效果不理想。胎肝细胞（fetal liver cell，FLC）在体外可以扩增，在刺激下可分化，免疫原性弱。取自妊娠 26 周和 34 周引产的胎肝细胞, 检测其活性为 95%, 代谢能力为成人的 75%5 。但其来源也很3受限，且存在伦理问题。11.2 动物肝细胞 为解决供体缺乏的问题，多年来研究者正致力于异种肝细胞移植的研究。动物肝细胞来源广泛，分离简便，效果可靠，Donato 等 6测定了人肝细胞、猪肝细胞、犬肝细胞、兔肝细胞、鼠肝细胞等钆细胞中细胞色素 P450 的含量
5、及代谢能力，猪肝细胞和人肝细胞的代谢功能最接近。然而异种移植用于临床仍有许多问题待解决。其一，猪肝细胞的内源性逆转录病毒感染受体，其安全性须进一步研究。其二，动物肝细胞不可能替代人类血浆蛋白合成酶活性，并存在有种间的特异性差异,并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能产生副作用7 ；为避免这种差异反应，病人血液和动物肝细胞之间必须有安全屏障,即半透膜的存在。故目前动物肝细胞多作为生物人工肝的生物成分而起作用8 。11.3 肝干细胞 1958 年 Wilson 和 Leduc9 提出肝干细胞的概念。近年来，研究发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有一定的治疗作用，使之成为肝脏领域的研究热点10 。根据肝
6、脏干细胞起源的不同，可将其分为肝源性肝脏干细胞和非肝源性肝脏干细胞，前者包括卵圆细胞、分化的肝细胞、胚胎肝细胞和胆管上皮细胞，后者则为源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞及胰腺上皮干细胞等不同来源的肝脏干细胞。在特定条件下，造血干细胞和骨髓间充质细胞均可转化成肝细胞。4动物实验证实, 肝干细胞在急性肝损伤时参与了肝脏肝细胞的再生和修复，并发挥了至关重要的作用，这样使肝干细胞移植用于临床治疗急性肝衰竭及肝代谢性疾病成为可能11 。但肝干细胞用于临床还有许多问题待解决，诸如肝干细胞在体外的鉴别、分离、培养及筛选，干细胞的多向分化潜能及可塑性这一生物学现象的发生和调控机制仍不清楚，干细胞移植的数量，移植后
7、在体内的归巢及定位等。相信随着研究的深入，肝干细胞希望能代替肝细胞的作用并应用于临床治疗。1.2 肝细胞的分离和培养1.2.1 肝细胞的分离 1969 年，Berry 和 Friend 等人用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配置成的消化液进行大鼠肝灌注，获得到肝细胞。之后，Seglen 创立了两步灌流法，即首先灌注预热的无钙的平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞，然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液，进行体外消化后，分离提纯而获得肝细胞。目前，国内外动物和人类肝细胞的分离方法都是在此基础上改良的。1.2.2 肝细胞的培养 肝细胞属高度分化类上皮细胞，对生存环境有着极高的要求，如培养液的温
8、度、pH 值、渗透压、 CO2 含量、5促肝细胞生长物质及血清浓度等，是影响肝细胞活性的重要因素；肝细胞与基质、肝细胞与非实质细胞的接触对肝细胞的生长和活性也起着极为重要的作用13 。肝细胞的培养须考虑到这些方面的问题。随着临床肝细胞移植及生物人工肝技术的研究和应用，需对肝细胞进行大量培养。在培养的容器中加入细胞外基质或载体，以尽可能模拟肝细胞生长的三维环境，对维持细胞形态、功能和活性有着重要作用。目前培养的方法主要有：（1）单层胶培养（ monolay） ；（2）胶原凝胶三明治结构（ collagen gel sandwich configuraton） ；（3）微载体粘附培养（microc
9、arrier culture） ，通过载体，使肝细胞成球形，扩大了细胞的交换面积，有利于肝细胞结构和功能的稳定；（4）微囊培养 （microcapsule culture） ，于微囊膜阻止了大分子物质（抗体、病毒）的通过，既保证了细胞营养，又起到免疫隔离作用；（5）中空纤维管培养（ hollow fiber culture） ，肝细胞借助管壁上的微孔与培养液相通，用于生物人工肝的治疗14 。1.3 肝细胞的冻存 为缓解供体器官的严重短缺，建立用于急诊肝细胞移植治疗所需的“肝细胞库” ，肝细胞冻存技术是关键。一般认为，低温冻存细胞的效果，取决于冷冻保护液、降温升温的速度和方式、贮存温度和贮存时间
10、的长短等15 。Jamal 等16 6通过对鼠肝细胞的冻存及复苏研究发现，冻存肝细胞活性较新鲜细胞明显下降（50%对 70%） ，但冻存的鼠肝细胞在体内仍保持着增殖活性。Makowka 等17用-70低温冰箱保存肝细胞，保存120 天活性保持在 50%60%。最近，Koizumi 等18 利用包胶囊法深低温保存鼠肝细胞，发现能够长期保持鼠肝细胞的药物代谢功能。任何冻存方法的最终目的是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成,从而保持解冻后细胞活性、粘附能力及代谢活性。人肝细胞的冻存目前尚没有一个标准的方法，国内外研究者积极致力于此领域的探索；温度的控制目前主要有计算机控制型冷冻仪实现的阶梯式降
11、温法和普通的- 20然后- 80 两步降温法；Guillouzo 等19报道两者并无差异。国内郭跃虎等 20报道用苦参碱与保护基剂二甲亚砜（DMSO）联合使用取得较好效果。相信随着科研的深入，肝细胞冻存技术不断提高，一定能建立起理想的“肝细胞库” ，用于临床肝细胞移植及生物人工肝治疗急性肝功能衰竭。2 肝细胞移植的临床应用 2.1 肝细胞移植途径 与肝移植相比，肝细胞移植简单易行，可通过微创手术或介入置管完成。目前主要的移植部位有：（1）门脉或肝内移植：从生理环境到细胞环境，肝脏是肝细胞的最佳生活空间。肝脏的组织结构，门脉血供的营养物质和生长因子以及激素，7使得移植的肝细胞在不改变微结构的情况
12、下与受体肝组织融合，肝功能能得到代偿。使用本途径较为安全，是较为常用的方法21 ，但偶会出现门脉高压及肺栓塞的风险。 （2）脾内移植：脾内网状组织有俘获和保护移植肝细胞不被吞噬细胞吞噬的作用，有利于细胞着床。同时脾内丰富的血供也为肝细胞的长期存活、增殖提供了有利条件。进一步的研究还发现, 肝细胞脾内移植可诱导特异性异体蛋白耐受。 在肝硬化成年患者，其脾脏较大约 8001200g, 而急性肝衰患者脾脏约 100150g。故对于慢性肝衰患者，脾内植入 6亿60 亿肝细胞途径相对安全和容易操作 22 。但脾脏移植细胞也有引起门静脉高压症及右心房压力升高并发症的可能性。 （3）其他途径：如腹腔、肠细膜
13、、皮下等。通过微创腹腔内肝细胞移植，肝细胞可存活 10 天以上。但腹腔移植可引起炎症反应及腹腔感染，且移植细胞的血管化需较长时间。总之，几种移植途径各有优缺点，目前的临床试验主要采用门脉肝内移植及脾内移植途径。2.2 肝细胞移植的临床效果 肝细胞移植目前主要应用于爆发型肝功能衰竭以及肝相关性代谢性疾病，能有效地提供近期或者远期肝功能支持23,24 。研究表明 25 ，移植后，肝细胞仍能维持正常的光镜和电镜结构，并能表达多种肝细胞功能，如白蛋白合成分泌、氨代谢、糖原储存和酵解、胆红素结合及细胞色素 P450 酶基因表达等。Soriano 等35用 real-time PCR 的方法检测了供肝肝细
14、胞的数量，同时通过对急性肝衰病人移植后的肝活检，证实8移植肝细胞在肝板及胆小管的浸润，这说明门脉内移植的肝细胞不仅可增殖分化，而且利用缝隙连接同受体肝细胞相连，通过毛细胆管分泌胆汁。作为整体器官移植的桥梁或替代治疗，肝细胞移植显示出很大价值和应用前景。结合文献报道，现将收集到的临床人肝细胞移植效果作一总结。2.2.1 治疗遗传性肝脏代谢性疾病 临床研究证明，肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病具有较好的效果。Grossman 等对 21例遗传性肝脏代谢性疾病患者行肝细胞移植治疗2632 ，见表1。5 例接受治疗的家族性高胆固醇血症患者行肝左外叶切除后，体外分离肝细胞，利用反转录技术导入 LD
15、L 蛋白受体基因，再由门脉移植入肝脏，移植 56 天后发现移植肝细胞增殖，2 周时达到峰值。随访 2 年，平均血清胆固醇下降 20%，移植肝细胞及转基因的功能存在，无 1 例肿瘤和感染发生。表 1 肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病 Hughes 等对 4 例 Crgler-Najjar 综合征患儿按整肝细胞量的 5%输入新鲜和深低温保存的肝细胞，移植后高胆红素平均下降了 30%50%，降低了核黄疸的发生，随访显示结合胆红素水平保持稳定水平达 3 年以上。患有凝血因子缺乏症的两兄弟，在接受整肝细胞量 5%新鲜肝9细胞及冻肝细胞移植（10 亿新鲜肝细胞， 22 亿冻肝细胞） ，结果显示凝血功
16、能明显改善，对外源性因子的依赖性减少了 80%, 由于静脉通路产生的并发症（两位患者均发生了导管相关性败学症）以及肝细胞移植长期疗效的不确定性稳定性，半年后所需外源性因子的量增加，提示移植肝细胞功能丧失，接受了肝脏移植。2 例 1A型糖原储存障碍儿童患者，经肝细胞移植治疗后（第 1 周输入 30亿，1 个月后再次输入 30 亿肝细胞）开始正常饮食而血糖水平稳定。其中 1 例患儿葡萄糖 6-磷酸激酶活性在移植后 3 周恢复到正常水平，并一直保持到 7 个月。1 例患先天性 Refsum 综合征的 4 岁患儿，经门脉行肝细胞移植（1 周内分 8 次输入总量 20 亿新鲜及冻存肝细胞） ，检测发现总胆酸下降，肝内胆汁淤积症状缓解，稳定到 18 个月后活检证实移植的肝细胞仍保持活性。4 例患有鸟氨酸缺陷症儿童分多次分别输入总量达 10 亿、40 亿及 19 亿的肝细胞，其中
