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1、细菌耐药性及其防治,复旦大学抗生素研究所,朱德妹 教授,本章节主要讲述内容,简述抗菌药物的作用机制细菌对抗菌药物的耐药机制细菌耐药性的遗传学基础主要细菌的耐药性变迁及实验室诊断细菌耐药性的防治,抗菌药物的作用机制,干扰细菌细胞壁的合成，使细菌不能生长繁殖。损伤细菌的细胞膜，破坏其屏障作用。影响细菌细胞蛋白质的合成，使细菌丧失生 长繁殖的物质基础。破坏核酸的代谢，阻碍遗传信息的复制。抑制细菌叶酸代谢等。,细菌主要的耐药机制,灭活酶与钝化酶的产生抗生素渗透屏障作用靶位结构改变细菌代谢状态，营养缺陷等细菌菌膜形成,耐药机制,灭活酶和钝化酶的产生内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素酰基转移酶MLS类抗生素钝
2、化酶（Macrolide-Licosamide Streptogramin）,-内酰胺环结构,-内酰胺酶分类,底物谱青霉素酶头孢菌素酶广谱酶：青霉素类、一、二代头孢菌素超广谱酶：三、四代头孢菌素、碳青霉烯类遗传学基础质粒酶、染色体酶可诱导性体质酶（固有的）、诱导酶,-内酰胺酶分类,-内酰胺酶分类,ESBLs分类,氨基糖苷类药物结构,氨基糖苷类钝化酶,乙酰转移酶 AAC（2） AAC（6） AAC（3）核苷转移酶 AAD（4） AAD（3） AAD（2） AAD（6）磷酸转移酶 APH（32,1,） APH（5”）APH（3”） APH（6） APH（2”）,耐药机制,抗生素渗透障碍：细胞壁障碍
3、或细胞膜通透性的改变，抗生素无法进入细胞内达到作用靶位而发挥作用。细胞壁：类脂双层，脂多糖（LPS），阻碍疏水性抗菌药物进入菌体。细胞外膜：OmpF，OmpA，OmpC孔蛋白丢失或减少，阻碍亲水性抗菌药物进入菌体。细胞内膜（胞浆膜）：产生新的能量依赖性转运系统。MexA-MexB-OprM。,主动外排系统,亲水脂药物,内膜转运载体,辅助蛋白,外膜,胞周间隙,外膜通道蛋白,胞质膜,耐药机制,靶位结构改变靶位酶：二氢叶酸合成酶靶位生理功能：细菌形态和活力靶位结构：MRSA，PBP2，DNA旋转酶,耐药机制,细菌代谢状态的改变：对氨苯甲酸产量（PABA）营养缺陷、L型细菌（无细胞壁）细菌菌膜的形成抗
4、菌药物不能透过整个菌膜菌膜对抗菌药物的敏感性降低菌膜内的细菌具有独特的生物学特征,4种主要耐药机制,泵出,失活,渗透障碍,靶位改变,主要耐药机制,染色体介导的耐药性,耐药基因位于染色体，随细菌分裂传至后代突变频率低：105109通常只对1，2种类似药物耐药产生或消失和药物存在无关耐药菌生长分裂变慢，竞争力变弱居次要地位,质粒介导的耐药性,染色体外的DNA耐药质粒：R.plasmid类型： 接合型（Conjugative plasmid） 耐药决定因子耐药转移因子非接合型（Nonconjugative plasmid）耐药决定因子转移方式： 接合型： 接合转移非接合型：转化，转导等方式,耐药性转
5、移方式,转化 Transformation转导 Transduction接合 Conjugation转座 Transposition,接合（Conjugation）,方式：通过耐药菌性菌毛和敏感菌菌体 的直接沟通，由耐药菌将耐药质粒边复制边转移给敏感菌。细菌：革兰阴性菌，特别是肠道细菌。发生频率：102108临床意义：可造成耐药菌的爆发流行， 种间，属间，牲畜与人,药敏试验,测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长效力，称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称细菌对药物的敏感性试验。,药敏试验的目的,为临床医师合理用药提供实验室依据。细菌耐药性监测，防止细菌耐药性发生和发展。为抗菌药物的管理和新药的开发研
6、究提供参考。,纸片扩散法（K-B）操作步骤,高度敏感,当一种细菌引起的感染，用该种药物常用剂量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。即常规用药时达到的平均血浓度超过对细菌MIC的5倍以上。,中度敏感,当细菌引起的感染，仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩部位，如尿液，胆汁等才被抑制，这种细菌对该药呈中度敏感。常规用药时达到平均血浓度，一般相当于或略高于对细菌的MIC,耐药,药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度。有时细菌能灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。,近年来革兰阳性菌的变迁主要表现为,金葡菌(尤其是MRSA)耐药株感染
7、的发生率增多凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)感染增多耐青霉素肺炎链球菌（PISP，PRSP）的出现和传播万古霉素耐药肠球菌（VRE）耐青霉素和耐头孢菌素类草绿色链球菌,近年来革兰阴性菌的变迁主要表现为,TEM-1流感嗜血杆菌大肠埃希菌对氟喹诺酮类的耐药率上升快克雷伯菌属ESBLs菌株肠杆菌属细菌嗜麦芽窄食单胞菌、黄杆菌,耐药细菌的检测,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林：1ug/片金葡菌 11-12mm凝固酶阴性葡萄球菌 17mm4%NaCl- 6ug/ml苯唑西林盐平板培养条件：35，24-48小时结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株,临床意义,耐万古霉素肠球菌检测,万古霉素纸片扩
8、散法含量：30ug/片结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药抑菌圈15-16mm为中度敏感，MIC抑菌圈17mm判定为敏感万古霉素耐药确证试验含6ug/ml万古霉素的MH平板1-10ul 0.5 5MacFarland Standard菌悬液35 ，24小时，1个菌落生长即判定为耐药,临床意义,耐青霉素肺炎链球菌的检测,苯唑西林：1ug/片抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（ MIC0.06ug/ml ）抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。 0.06ug/ml S0.125-1ug/ml I 2ug/ml R,临床意义,E
9、SBL细菌的检测,筛选试验头孢泊肟：10ug/片 22mm头孢他啶：30ug/片 22mm头孢噻肟：30ug/片 27mm头孢曲松：30ug/片 25mm氨曲南： 30ug/片 27mm任何一种以上药物进行筛选，出现上述结果疑为ESBL产生株。,ESBL细菌的检测,确证试验头孢他啶（30ug/片）、头孢他啶/克拉维酸（30/10ug） 头孢噻肟(30ug/片)、头孢噻肟/克拉维酸（ 30/10ug ）上述任何一种组合中复方制剂的抑菌圈直径与单药抑菌圈直径相比，5mm可判定为ESBL产生株。,临床意义,确认为ESBLs菌株的感染，不宜使用头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松等含氧亚氨基侧链的头孢菌素。根
10、据药敏结果宜选择碳青霉烯类、酶抑制剂复合制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物。,双纸片测定的图示,A 抗生素纸片次序B E D A：CAZ B：CTX C：ATM C D：CRO E：AMC,ESBLs判断标准：出现“ 匙扣”或“ 坑”协同作用现象,AmpC酶的检测,AmpC酶和ESBL酶的特点,确认AmpC酶菌株感染：可选用碳青霉烯类抗菌 药物，亦可选用第四代头孢菌素，重症感染者需 联合氨基糖苷类抗生素。,三维改良法检测AmpC酶,耐药性的防治措施,合理使用抗菌药物建立细菌耐药性监测网严格掌握用药的适应症掌握适当的剂量与疗程,头霉素类抗生素,耐药性的防治措施,新抗菌药物的寻找和研制针对耐药发生的机制，抗菌药物的结构开发新药。,耐药性的防治措施,新抗菌药物的寻找和研制寻找适当的酶抑制剂，生产新的内酰胺抗生素/酶抑制剂复方制剂目前已有三种酶抑制剂克拉维酸 舒巴坦 三唑巴坦。有五种酶抑制剂与内酰胺类的复方制剂优立新（氨苄西林/舒巴坦）特治星（哌拉西林/三唑巴坦）舒普深（头孢哌酮/舒巴坦）安美汀（奥格门汀/克拉维酸）特美汀（替卡西林/克拉维酸）,耐药基因消除剂,基因文库或临床筛选-内酰胺类耐药菌株,获取-DNA序列,设计EGS,构建-EGS片段,工作基础30070903,构建质粒,克隆入,筛选收集临床耐药大肠杆菌各种内酰胺类抗生素的MICCefinase测定,
