《BD FACSCalibur流式细胞术标准操作规程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BD FACSCalibur流式细胞术标准操作规程（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 1 / 10BD FACSCalibur 流式细胞仪操作与维护程序目 的：规范 BD FACSCalibur 流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。适用范围：本规程适用于 BD FACSCalibur 流式细胞仪的使用操作。责 任 者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。内 容：1. 每日开机程序1.1 在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1 鞘液充满状态，约 3L1.1.2 盖紧盖子1.1.3
2、 安上金属挡板1.1.4 管路畅通，无扭曲1.2. 检查废液桶，确认：1.2.1 废液桶充满 400ml 漂白剂1.2.2 管路畅通，无扭曲1.3 打开流式细胞仪。1.4 打开电脑。1.5 气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。1.6 做 Prime。1.7 等待机器预热 510 分钟后可开始试验。2. 每日关机程序2.1 用 3mlFACSClean 洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入 1ml。2.2 将样品支撑架置于中位，以 HI RUN 运行 10 分钟，使内管吸入约 1ml。2.3 将样品管换成蒸馏水重复 1-2 步。2.4 放置盛有 1ml 蒸馏水的试管于样品支
3、撑架上。2.5 选择 Standby 模式 10 分钟，将激光冷却后可关掉主机。2.6 退出所有应用软件，关闭电脑。2.7 将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。3. 每月维护程序3.1 将 FACSClean 洗液 12L 装入鞘液桶。3.2 旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从 SANLINE FILTER 端断开，将鞘液白色管路液路取下 2 / 10联到 SANLINE FILTER 端口） ，以防伤害。3.3 将盛有 3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以 HI RUN 30 分钟。3.4 将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤 3，以 HI RUN 60 分钟。3.5 将鞘液桶
4、装满鞘液，恢复过滤器。3.6 以 HI RUN 10-20 分钟。3.7 在测定正式样品之前实施每日开机程序。4. FACScomp 自动质控操作4.1 试剂准备4.1.1 三色试剂的校正（Cat No：340486）4.1.1.1 取四色试剂盒中的 Unlabeled 试剂，充分混匀，加一滴到装有 1ml 鞘液的试管中，混匀，标记为 unlabeled。4.1.1.2 取 FITC、PE、PerCP、unlabeled 试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有 2ml 的鞘液的试管中，混匀，标记为 mixed。4.1.1.3 上机进行仪器的校准。4.1.2 或四色试剂的校正（Cat No：340
5、486；Cat No:340487）4.1.2.1 取试剂盒中的 unlabeled 试剂和 APC 试剂各一滴加入到第一支装有 1ml 鞘液的试管中，混匀。4.1.2.2 取 5 种试剂（FITC、PE、PerCP、APC、Unlabeled）各一滴加入第二支装有 2ml 鞘液的试管中，混匀。4.1.2.3 上级进行仪器的校准。4.2 Calibrite beads FACScomp 上机操作的具体步骤4.2.1 执行 FACSalibur 开机程序；4.2.2 执行 FACScomp 软件；4.2.3 在运行“Sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些
6、信息；单机“Acceppt” ；4.2.4 进入”Set Up 窗口，先看最左侧的 Assay selection 选项，在里面选中 Lyse/Wash 或Lyse/No Wash；4.2.5 在 Calibrite Beads Lot IDS 中，根据每种颜色的 beads 所对应的 Lot ids，输入编号，次编号在 Calibrite Beads 试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背面，标题是 Calibrite BeadsTM3Batch NO，选择 FACS Flow Sheath 下的编号(右侧的编号)；如做四色校正，同样方法输入 Calibrite
7、BeadsTM APC 的 IDS。4.2.6 在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径 FacstationBD fileFACSCompDDMMYY,还可以单击“Location”改变保存路径；4.2.7 其他的不要改动，直接单击“run”出现 PMT 视窗，然后准备好上样管；4.2.8 上第一管后单击 start，仪器开始自动调节 PMT。完成后仪器会在窗口底部出现一行提示：“PMTs set Successfully”，这时软件会暂停 5 秒，然后自动进入下一个调节窗口(Comp 窗口)； 3 / 10如果是四色微球调试，仪器还会对激光的延迟进行测试，直到仪器电脑屏幕出现提示:“Time
8、 Delay Calibration was successful”，然后才会同样自动进入下一个调节窗口（Comp 窗口） ；4.2.9 上第二管，单击 start，仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。完成后仪器会给出提示，最后软件给出一个 Summary Report。检查报告中的“Result”是否都 PASS，如果有没有 PASS，坚持原因。 （1）是否试剂过期（2）两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常维护是否充分适当（5）联系 BD 人员4.2.10 打印报告，退出 FACScomp 软件；4.2.11 计算机会自动把 FACScomp 测试结果保存在 C
9、alib File 或 Calib File .LNW（免洗试验）中，运行其他程序，调用这些结果就可以进行样本的检测。注意事项：1、第一管的速率不能低于 400 个/秒（run high） ，少于时可以补一滴 Unlabeled。2、两个试管中的鞘液必须和鞘液桶中的是同一种液体。5.FACScomp 校正 HLA-B27 的操作说明5.1 试剂的准备：取 HLA-B27 试剂盒的 HLA-B27 calibration beads (Cat No：340183)试剂，混匀，加两滴到装有 1ml 鞘液的试管中，混匀，待测。5.2 FACScomp 上机检测 HLA-B27 的具体步骤5.2.1
10、执行 FACSCalibur 开机程序；5.2.2 运行 FACScomp 软件；5.2.3 在出现“Sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“Accept” ；5.2.4 进入“Set up”窗口，先看最左侧的 Assay selection 选项，选择 HLA-B27 Assay，在进行HLA-B27 Assay 之前，必须一次性的通过 Lyse/Wash Assay 校正；5.2.5 在右侧框中输入正确的 HLA-B27 Lot No 值、Suffix 值和 Beads Lot No 值。这些参数分别决定了 FL1 PMT 的标准和 de
11、cision maker 的位置。对于结果至关重要，不可弄错；5.2.6 在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径 FacstationBD fileFACSComp日期，还可以单击“Location”改变文件保存路径；其他的不需要改动，直接单击“run”出现 PMT 视窗，然后准备好上样；5.2.7 放上 Beads 管后单击 start，仪器开始自动调节 PMT。完成后仪器会在底部出现一行提示：“PMTs set successfully”这时软件会暂停 5 秒，调试后的结果会自动保存在 Calib File.B27 中，并生成 summary Report；5.2.8 退出 FACScom
12、p 软件，然后进入 HLA-B27 软件进行检测。6.MultiSET 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数6.1 实验原理：用已知总数的荧光微球 Beads 做标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中 CD3、CD4、CD8、B、NK 细胞的绝对数。细胞（/ul）=（细胞获取数Beads 总量）/（Beads 获取数样本量）6.2 主要试剂：6.2.1 抗体：CD3/CD8/CD45/CD4；CD3/CD16+56/CD45/CD19 四色荧光抗体。6.2.2Trucount 管（内含数量已知的 Beads） 。6.2.3FACS Lysing Solu
13、tion（溶血素） （10,使用前用蒸馏水稀释成 1）6.3 实验步骤:6.3.1 取 2 支 TruCount 管,顺序编号 A 和 B;6.3.2 用反向加样法在 Tube 中加入 50ul 充分混匀的抗凝全血;注意:血不要碰到试管底部的微球(Beads)。 4 / 106.3.3 取 20ulCD3/CD8/CD45/CD4 抗体加入到 A 管中；取 20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19 抗体加入到B 管中。注意：不要碰到血。涡旋混匀，室温避光放置 15-20min；6.3.4 加入 450ul 1FACS 溶血素，充分混匀，室温避光放置 15min；6.3.5 24 小时
14、内上机，用 MultiSET 软件获取 15000 个细胞进行检测，上机前应充分混匀。6.4 注意事项：6.4.1 样本使用 EDTA 抗凝全血，室温放置，24 小时内处理，处理前充分混匀。6.4.2 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二挡，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。6.4.3 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀，过程中尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。6.4.4 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。6.4.5TruCOUNT 管 2-25保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证 TruCOUNT 管包装袋密闭
15、，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT 管应弃去不要7MultiSET 软件收获分析的具体操作7.1 执行 FACSCalibur 开机程序，进入 MuliTSET 软件。7.2 在出现“sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、负责人姓名等信息，计算机将保存这些信息；相关信息，单机“Accept” 。7.3 进入“set up”窗口：7.3.1 在“Data Source”对话框中选择“From Cytometer：Acquisition and Analysis” ；7.3.2 在“Automatic Saving Options”中选者“Data File”、 “laborator
16、y Report”、“Physician Report”，软甲会自动生成并保存报告文件，文件的默认路径 FaacstationBD fileMultisetDDYYMM 文件夹；7.4 在“View Report”中选择“Until NextButton Pressed”.7.5 然后单击“Accept” ，进入“FACSComp”窗口，单击“skip FACSComp”（四色仪器调整FACSComp 在检测前单独完成，见 FACSComp 操作部分） 。7.6 进入“Test Prefs”窗口，在“Physicians Report Choices”一项可以全选，运行一种试剂，会自动报告相应的结果。在“Lot ID”中输入 TruCount 管批号和 Beads 总数（标在包装袋上） ，单击“Accept” 。7.7 进入“Samples”窗口，在表格中输入相应的 Patient Name、IDCase Number 和在 Panel 中选择 4color TBNK+Truc；7.8 在窗口最
