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1、1白介素 2 抑制 T 细胞特异性免疫应答机制的研究作者：张腾龙,谢彦晖, 王缨,林果为 【摘要 】 本研究查明白介素 2（IL2 ）对静息 T 细胞抗原特异性免疫应答的作用，探讨 IL2 对静息 T 细胞中细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3 )表达的影响，及其与抗原特异性免疫应答的关系。用 IL2（50 U/ml）预处理静息 DO11.10 T 细胞，洗涤去除 IL2 后用 3HTdR 掺入法检测静息 DO11.10 T 细胞针对 OVA323-329 抗原(ovalbumin，OVA ，卵清蛋白)的特异性增殖；用 IL
2、2（50 U/ml）刺激静息 DO11.10 T 细胞，然后用荧光实时定量 PCR 法检测 SOCS3 在刺激后不同时间的表达变化；用 OVA323-329 抗原活化静息 DO11.10 T 细胞，然后检测 SOCS3 在抗原活化后不同时间的表达变化。结果表明：静息 DO11.10 T 细胞经 IL2 刺激后抗原特异性增殖能力减弱；静息 DO11.10 T 细胞经 IL2 刺激后SOCS3 表达上调，在刺激 4 小时后表达即明显上调，6 小时后达到最高峰；静息 DO11.10 T 细胞经 OVA323-329 抗原活化后SOCS3 表达明显下调，在活化后第 2 天降至最低，4 天后基本恢复正常
3、。结论： IL2 在一定条件下可抑制静息 T 细胞抗原特异性免疫应答，而且这种抑制作用可能与 SOCS3 表达上调有关。 2【关键词】 IL2； DO11.10 T 细胞；SOCS3 ；OVA323-329抗原Abstract The study was aimed to investigate the effect of IL2 on the acquired immune response of naive T cells，and to explore the influence of IL2 on suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) ex
4、pression of naive T cells, as well as to elucidate the role of SOCS3 on antigen specific immune response in vitro. Naive DO11.10 T cells were prestimulated with IL2 (50 U/ml), and stimulated with OVA323-329 antigen after removing IL2, then the proliferation of naive DO11.10 T cells was detected. Nai
5、ve DO11.10 T cells were stimulated with IL2 (50 U/ml), and SOCS3 expression was detected by realtime PCR. Naive DO11.10 T cells were stimulated with OVA323-329 antigen, and SOCS3 expression was detected by means of 3HTdR. The results showed that after IL2 prestimulation, the proliferation of naive D
6、O11.10 T cells decreased significantly when stimulated with OVA323-329 antigen; SOCS3 expression of naive DO11.10 T cells was upregulated significantly after IL2 stimulation, the upregulation began obviously at 4 hours and reached peak 3at 6 hours. SOCS3 expression on naive DO11.10 T cells was downr
7、egulated markedly after OVA323-329 antigen stimulation, the expression level of SOCS3 was lowest on day 2 and returned to normal on day 4 after stimulation. It is concluded that the antigen specific immune response of naive DO11.10 T cells is inhibited after prestimulation with IL2, which may be med
8、iated by SOCS3.Key words IL2; DO11.10 T cell; SOCS3; OVA323-329 antigen白介素 2（interleukin2, IL2）作为一种免疫增强制剂被广泛应用于肿瘤和艾滋病的临床治疗1，2 ，但只有大约 20%的患者有治疗效果3 ，而且在某些治疗中应用 IL2 后反而产生免疫抑制的现象4 ，其具体机制尚不清楚。有研究发现，IL2 除能扩大免疫反应外，还可诱导免疫耐受，认为这一作用可能与调节 T 细胞（Treg 细胞）有关5 。另外还有研究发现，在一定条件下 IL2刺激 T 细胞可以诱导细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor
9、of cytokine signaling 3，SOCS3) 表达上调 6 ，而 SOCS3 是机体免疫应答的抑制因子7 。因此，IL2 可能通过诱导 SOCS3的表达来抑制 T 细胞对抗原的应答。 为此， 我们以小鼠抗原特异性 T 细胞 （DO11. 10 T 细胞）为研究对象，研究 IL2 对 T 细胞4抗原特异性应答的影响，同时研究 T 细胞免疫应答与 SOCS3 变化的相关性。主要试剂与仪器TRIzoL 购自北京鼎国生物公司，小鼠 IL2 为 Sigma 公司产品，realtime PCR Master Mix 为 Toyobo 公司产品，逆转录试剂与dNTP 购自 MBI 公司，丝裂
10、霉素为日本 Kyowa 公司产品，Taq DNA 聚和酶购自 Tiangen 公司，所有引物均由上海生工生物公司合成。SN6904 液体闪烁计数仪由上海原子核研究所日环仪器一厂生产，LightCyclerTM 定量 PCR 仪为 Roche 公司产品，PE 240型 PCR 仪为 Perkin Elmer 公司产品。动物DO11.10 TCR 转基因小鼠为卵清蛋白(Ovalbumin ，OVA)抗原特异性小鼠，均为 SPF 级，雌性，6-8 周龄，15-20 g，由中国科学院上海动物中心饲养。静息 DO11.10 T 细胞（ naive DO11.10 T cell）的 IL2 预处理颈椎脱臼
11、法处死 DO11.10 TCR 转基因小鼠，用尼龙毛柱分离5DO11.10 T 细胞，以 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度，铺入 24 孔板中，每孔 1107/2 ml，然后加入浓度为 50 U/ml 的 IL26 ，于 37、5 C02、饱和湿度培养箱中培养。SOCS3 基因的检测总 RNA 提取与 cDNA 制备 用 IL2 预处理静息 DO11.10 T 细胞后每 2 小时裂解细胞（ 0、2、4 、6、8 、10 、12 小时） ，按照TRIzoL reagent 操作说明抽提总 RNA，溶解于 10 l DEPC 水中。逆转录反应以 OligodT 为引物，操作按 MBI 试剂说
12、明书进行。聚合酶链反应（PCR ） 此制备的 cDNA 为模板，操作按 Taq DNA 聚和酶操作说明进行，SOCS3 引物上游序列为：5TGCGCCATGGTCACCCACAGC AAGTTT3，下游：5GCTCCTTAAAGTGGAGCA TCATACTGA3。荧光实时定量 PCR（real timePCR）以上法制备的 cDNA 为模板，按 realtime PCR Master Mix说明书进行操作，SOCS3 引物上游为：5CAAGTCATCACTATTGGCAACGA3,下游：5CC CAAGAAGGAAGGCTGGA3。actin 引物上游:65CCAGCCATGTACGTTGC
13、TATC3,下游: 5CA GGTCCAGACGCAGGATGGC3。DO11.10 T 细胞抗原特异性增殖实验首先将分离的静息 T 细胞在含有 IL2（50 U/ml）的 RPMI 1640 培养液中预处理 6 小时，洗涤去除 IL2 后加入 96 孔板中（1105/well） 。以丝裂霉素（100 g/ml）灭活的 DO11.10 TCR转基因小鼠脾细胞作抗原呈递细胞（4105/well） 。OVA323-329特异性抗原终浓度为 0.6 mol/L。37 、5 CO2 培养 5 天，终止培养前 18 小时加 3HTdR (0.5 Ciwell)，用 液闪计数仪测cpm 值。本实验设 3
14、个复孔，设未经 IL2 预处理的静息 DO11.10 T 细胞组为对照组。统计学分析采用 SPSS 13.0 软件处理，用单因素方差分析（oneway ANOVA）统计方法分析数据， P0.01 为有统计学意义。结 果IL2 体外抑制静息 T 细胞抗原特异性增殖7IL2 的所有作用都是通过与 IL2 受体（IL2R ）结合来实现的。免疫应答中，T 细胞经抗原活化后高表达 CD25（IL2R 亚基）,此时 IL2 作用于 T 细胞，能够与 CD25 结合促进 T 细胞增殖，增强免疫反应。而 T 细胞未接受抗原活化前（静息 T 细胞）基本不表达CD255 ，因此用 IL2 刺激静息 T 细胞并不会
15、促其增殖，但IL2 对静息 T 细胞的影响尚不清楚。本研究以 DO11.10 转基因小鼠静息 T 细胞（静息 DO11.10 T 细胞，为 OVA 抗原特异性 T 细胞）作为研究对象。静息 DO11.10 T 细胞经尼龙毛柱法分离后用 FACS鉴定纯度可达 90以上，在接受抗原特异性活化之前先用 IL2 预处理 6 小时，然后再用 OVA323-329 抗原刺激，最后用 3HTdR掺入法检测其针对 OVA323-329 抗原的特异性增殖。结果发现，经IL2 预处理 6 小时的静息 DO11.10 T 细胞的抗原特异性增殖较之正常对照组（静息 DO11.10 T 细胞未经 IL2 预处理组）明显
16、下降（P0.01） （图 1） 。IL2 预处理静息 T 细胞可以诱导 SOCS3 表达上调由前面得知，IL2 预处理静息 DO11.10 T 细胞可以抑制其抗原特异性增殖，而未经 IL2 预处理的静息 DO11.10 T 细胞的抗原特异性增殖未受抑制，导致这种差异的原因就在于 T 细胞在接受OVA323-329 抗原刺激前是否经过 IL2 的预处理。Cohney 等6研究发现，IL2 刺激 T 细胞可以诱导 JAK/STAT 信号传导通8路的反馈抑制分子（SOCS3 ）蛋白的表达上调，因此我们进一步检测在 IL2 预处理的过程中是否伴有 SOCS3 表达水平的变化。realtime PCR 法
