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1、1活性氧和细胞凋亡进入九十年代以来，越来越多的肿瘤、发育和神经生物学家、免疫学家和其他生物学工作者以极大的热情致力于细胞凋亡(apoptosis)或称细胞程序化死亡的研究，使之成为当今生命科学研究中最引人注目的领域之一。许多研究显示活性氧(reactiveosygenspecies,ROS)，即氧自由基及其衍生物与细胞凋亡密切相关。例如，低浓度的 H2O2 能诱导某些类型的细胞 (如血管内皮细胞、HL60 细胞)凋亡，氧化的低密度脂蛋白可诱导淋巴细胞凋亡，过氧亚硝基自由基可诱导胸腺细胞凋亡，等。本文拟就 ROS 和细胞凋亡的关系作进一步综述。 1 ROS 和凋亡细胞的线粒体功能变化的关系 细胞
2、游离系统(cellfreesystem) 为认识细胞凋亡机制提供了良好的模型。该系统通过分离细胞核和细胞浆，制备去核细胞(cytoplast)和无浆细胞，可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。以此为基础的两大发现强力地揭示线粒体在细胞凋亡中的重要性：细胞自发的受 Bcl-2 抑制的核固缩和 DNA 裂解依赖线粒体的存在；caspase 的活化依赖细胞色素 C 自线粒体释放。2随后的研究显示各种因素诱导的细胞凋亡均出现线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(m)的破坏。业已清楚，造成m 下降的主要原因是线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放。MPT 位于线粒体内、外膜之间，由一组蛋白复合体构
3、成。许多因素可影响 MPT 的开关。其中，定位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)发挥重要作用。ANT 分子的构象改变，尤其是其相邻巯基的氧化还原状态明显影响 MPT 的开关。当相邻巯基氧化为二硫键或类似于二硫键的交联复合物时，MPT 开放。反之，MPT 关闭1 。因此，MPT的开放及m 的破坏与细胞的氧化还原状态，如巯基氧化、细胞GSH 缺少和 ROS 的堆积密切相关。Macho 等2在研究胸腺细胞凋亡机制中发现，早期凋亡细胞胞内 GSH 下降和 ROS 含量轻度升高。后者进一步引起 NADH 和 NADPH 下降，产生大量超氧阴离子自由基。因此，在凋亡过程中，ROS 既是促发和加速
4、 MPT 开放重要效应分子，又是 MPT 开放的产物。这种正反馈机制使 MPT开放具有自我放大效应和“全”或“无”的特点，使线粒体m 的下降进入不可逆过程，细胞发生凋亡。 2 ROS 和凋亡信号传导分子 Ca2的关系 自从 Kaiser 等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与 Ca23离子内流增加有关以来，越来越多的直接或间接证据表明胞浆Ca2浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。Ca2 作为第二信使或死亡信号传导分子，通过参与某些和细胞凋亡相关的蛋白激酶和核酸酶的活化介导细胞凋亡。实际上，在细胞凋亡过程中胞内 Ca2浓度上升和 ROS 的产生、堆积之间也存在密切联系，而且后者往往先于胞内 Ca2浓
5、度的上升。例如，Tan 等 3发现神经细胞系HT22 凋亡过程中， ROS 的大量产生先于胞内 Ca2浓度的持续上升。进一步地，ROS 的产生被 FCCP(一种能够抑制线粒体呼吸链产生 ROS 的芳香族化合物)阻断后，胞内 Ca2水平升高不明显。反之，当 Ca2的内流被钴阻断时，胞内 ROS 的产生和堆积也受到抑制。因此，他们认为在凋亡早期贮存于内质网或线粒体的 Ca2释放引起胞内 Ca2水平轻度升高，并协同其它因素( 如 GSH 的下降等)引发线粒体大量产生 ROS，而 ROS 进一步促进胞内 Ca2浓度持续升高。David4等发现抗氧化剂和 MPT 抑制剂能够抑制糖皮质激素诱导的胸腺细胞内
6、 Ca2水平的升高，进而抑制凋亡。他们认为凋亡中产生的 ROS 可能引起细胞内贮存 Ca2的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏，导致胞内 Ca2重分布和胞外Ca2的内流，从而引起细胞内持续的 Ca2水平升高。总之，ROS 的产生堆积和 Ca2水平的升高都是细胞凋亡中的重要事件，且两者相互促进，在细胞凋亡中发挥重要作用。 43 ROS 与调亡调控蛋白 Bcl-2 关系 Bcl-2 基因所编码的蛋白质属于胞内膜整合蛋白。它对大多数因素诱导的细胞凋亡具有负性调节作用。Bcl-2 家族则包括诱导凋亡和抑制凋亡两大亚家族。前者如 Bax、Bcl-xs、Bik、Bak 等，后者除 Bcl-2 外，还有
7、Bcl-XL、Ced-9 等。Bcl-2 家族成员大多数由C 端跨膜结构域(TM)和 14 个 BH(Bcl-2Homology)结构域构成。近来在对 Bcl-2 作用机制研究中发现 Bcl- 2 抑制细胞凋亡作用可能涉及 Bcl-2 对凋亡过程中 ROS 产生的影响。Hochman5 等发现敲除 Bcl-2 基因的小鼠神经细胞内氧化蛋白含量明显升高，而且对各种氧应激特别敏，表明失去 Bcl-2 导致细胞氧化损伤增加和抗氧化能力的下降。Kane6等发现表达 Bcl-2 的 GT17 神经细胞在去除 GSH 时，胞膜脂质过氧化等氧化损伤无明显增加，而且胞内 ROS 水平也无明显升高。Hochma
8、n 等认为 Bcl-2 蛋白是一种ROS 清除剂，能有效清除超氧阴离子等氧自由基，抑制过氧化物产生及 ROS 对细胞的损伤。同时，Bcl-2 蛋白能够调节并维持细胞内抗氧化剂的活性，并根据 Bcl-2 蛋白主要位于细胞内 ROS 产生的部位，如线粒体膜，内质网膜，核膜等，推测 Bcl-2 蛋白能够调节细胞尤其是线粒体内 ROS 的产生。此外，Bcl-2 蛋白可能阻断 ROS对线粒体膜通诱性的影响及由于膜通透性下降引起的细胞色素 C、凋亡诱导因子(AIF)等释放。但是，Satho 等7发现在 PC12 细5胞，Bcl-2 并不能降低氧应激引起的 ROS 产生，但能阻止线粒体m 的下降。Motyl
9、 等 8报道 TGF-1 诱导小鼠淋巴细胞性白血病细胞系 L1210 胞内 Bcl-2 水平下降和胞内 ROS 水平升高，且出现于 TGF-1 加入后 2448 小时，但在此之前胞内已有一次 ROS含量的增加。显然，第一次 ROS 升高与 Bcl-2 下降无关。综上所述，Bcl-2 作为凋亡负性调控基因，可能并不能抑制凋亡诱导因子引起的细胞内初次 ROS 的产生，但 Bcl-2 能够阻断第二次大量 ROS 的产生(主要是由线粒体功能改变引起的 ROS 产生)。 4 ROS 与 FAS/FAS 配体、TNF 及其它细胞毒性分子诱导凋亡的关系 FAS/APO-1(CD95)是一种型跨膜受体蛋白，由
10、胞外结合区、跨膜区、及胞内区域构成，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家庭。FAS 通过与其拮抗剂和天然配体(FASL)相互结合，引起FADD，Caspases 等一系列复合物、酶的链级活化，最终诱导细胞凋亡。近来研究发现，在 FAS/FAS 配体(FASL)诱导的细胞凋亡过程中，FAS 和 FASL 交联能够引起细胞内 ROS 含量增加和细胞氧化还原状态的改变。Suzuki 等9用化学荧光指示剂Chemluminescence(该指示剂能与包括 O2、OH、单线氧等各6种 ROS 反应)观察 B 淋巴瘤细胞株 BJAB 和 Ramos 以及 T 淋巴细胞性白血病细胞株 Jurkat 在 FAS
11、/FASL 交联后胞内 ROS 含量变化，发现 FAS/FASL 交联引起细胞内迅速和特异性 ROS 的产生，而且这此细胞内 ROS 产生过程基本相同。ROS 大都在 FAS/FASL 交联后20 秒内产生，5 分钟后达到高峰，然后缓慢下降，但 ROS 水平升高至少维持 40 分钟，而 FAS 引起的 ROS 增加可被DP(dipenylene iodonium chloride,NADPH 氧化酶抑制剂)所抑制，提示 FAS 介导的 ROS 增加可能主要通过 NADPH 氧化酶系统产生。当 FAS/FASL 交联引起的胞内 ROS 产生被各种抗氧化剂(如GSH、NAC、疏基还原剂等 )所阻断
12、时，FAS 介导的细胞凋亡也被抑制，如提高外周活化 T 细胞内 GSH 含量，能够降低 T 细胞对FAS 介导凋亡的敏感性。有研究表明 H2O2 能够激活蛋白酪氨酸激酶(PTK)，而 PTK 的活化是 FAS 介导细胞凋亡必要步骤，可以推测，FAS/FASL 交联后引起胞内产生的 ROS 激活 PTK，然后在 PTK 作用下促发一系列凋亡链级反应。因此，ROS 不仅是 FAS/FASL 交联后的产物，而且在 FAS/FASL 诱导的细胞凋亡中发挥了重要作用。 ROS 在 -TNF 诱导的细胞凋亡中也起着重要的介导作用。Gotoh 等10发现 -TNF 作用于“293”细胞，引起胞内凋亡信号调控
13、激酶 1(ASK1)的活化和细胞凋亡。ASK1 的激活可被抗氧化剂所阻断，而过氧化氢可导致 ASK1 的活化。作者认为 -TNF 诱7导的凋亡中 ASK1 活化是通过 ROS 介导的。具体地，ROS 可能通过促使 ASK1 形成二聚体而激活 ASK1。但是， Sidoti11等认为 -TNF 诱导 Hala 细胞凋亡至少存在二条独立的凋亡途径，其中一条途径需要 ROS 参与，而另一途径则无需 ROS 的介导。 细菌生物碱 staurosporine 能够诱导包括神经细胞在内的许多细胞发生凋亡。Kruman12等在研究 staurosporine 诱导PC12 细胞凋亡机制中发现，stauros
14、porine 作用于细胞，首先引起胞内 Ca2水平的上升和线粒体产生 ROS 增多和堆积，然后出现 胞膜脂质过氧化，线粒体m 下降，以及细胞核凋亡特征性的改变，而 Ca2的鏊合剂 BAPTA 和 ROS 清除剂尿酸均能抑制staurosporine 诱导的细胞凋亡，提示胞内 Ca2水平的上升和ROS 的堆积是 staurosporine 诱导细胞凋亡所必须的。近来，Ahlemeyer13等发现雏鸡胚胎神经细胞经 staurosporine 处理后 4 小时，细胞内 ROS 水平增高 4 倍，60细胞凋亡，而在加入10mmol 全反式维甲酸(RA)后，同样经 staurosporine 处理，细
15、胞内 ROS 增高幅度降至 2 倍，而凋亡细胞也降至 38，这可能是 RA抑制胞内 ROS 产生和堆积有关。 最近，Rollet-Labelle14等发现黄嘌呤氧化酶(XO) 和葡8萄糖氧化酶(GO)作用于中性粒细胞，引起细胞内 H2O2 及 OH。含量增加，加速细胞凋亡。这种效应可被 OH。鏊合剂 HBED 所抑制，提示 OH。可能是中性粒细胞凋亡的介导因子。此外，Lee 等15发现 KIT(一种酪氨酸激酶受体，属于血小板生长因子受体家族)通过阻止小鼠 DP16Friend 红白血病细胞株内 ROS 的产生而抑制 p53 诱导的凋亡。ROS 诱导或介导的 T 细胞凋亡也参与 HIV 病毒感染
16、患者的 T 淋巴细胞减少16 。 5 ROS 和药物诱导细胞凋亡的关系 随着对细胞凋亡机制研究深入，具有凋亡诱导作用的药物不断被发现。ROS 在这些药物诱导的细胞凋亡中可能发挥了重要作用。首先，ROS 在多种抗肿瘤药物诱导凋亡过程中起着介导和调节作用，例如，化疗药物去甲氧柔红霉素(doxorubicin)诱导白血病和神经母细胞瘤凋亡与肿瘤细胞内 ROS 的产生密切相关，而抗氧化剂(如谷胱甘肽等)阻断细胞内 ROS 的产生，并明显抑制去甲氧柔红霉素诱导的肿瘤细胞凋亡，相应地，对该药不敏感的肿瘤细胞有较高的胞内 GSH 水平，降低这些细胞内 GSH 含量可使胞内 ROS 大量产生并可恢复耐药肿瘤细胞对去甲氧柔红霉素的敏感性17 。无独有偶，三氧化二砷(As2O3)诱导肿瘤细胞凋亡过程中，细胞内 ROS 的9产生一旦被阻断则 As2O3 诱
