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1、ABSTRACT最近我们报导了离体情况下，SMAD 独立性骨形态生成蛋白 4（BMP4）信号通路在造血干细胞/祖细胞（HSPCs）中活化，影响了它们导向骨髓（BM）的过程。本文中，我们评估了活体中，影响 BM 龛是否会导致 BMP 信号传递过程发生改变。我们揭示了注入 BMP拮抗剂头蛋白（Noggin）来抑制 SMAD 依赖性 BMP 信号转导，显著增加了 BM 血浆中CXCL12 的水平，增强了植入 HSPCs 的导向与血管生成。反过来，注入 BMP7 而不是BMP4，造成 HSPC 导向能力下降。利用 ST2 细胞充当 BM 龛的体外模型，我们发现在中和抗 BMP4 抗体， NGN，或背成
2、形因子（ Dorsomorphin, DM）同时敲除掉 Smad1/5 及 BMP4的条件下孵化，所有这些都增强了 CXCL12 的产生。染色质免疫沉淀分析识别出了 CXCL12启动子中与 SMAD4 结合的元件。删除这个元件后，观察到 CXCL12 启动子活性增加，并且NGN 或 DM 不再影响 Cxcl12 表达。有趣的是，BMP7 表达只出现在成骨细胞中，不出现在其它龛成分中。因此，我们将 SMAD 依赖性 BMP 信号转导描述为 BM 龛中一种新的CXCL12 生产调控因子，影响 HSPC 的导向，移植成活以及运动。INTRODUCTION在治疗多种类型癌症，骨髓（BM）衰竭中，遗传性
3、代谢障碍，以及严重先天性免疫缺陷时，常常使用造血干细胞（HSC）移植（1） 。在骨髓中， HSCs 与其所处的微环境相互作用，这种微环境也称为“龛” 。最初提出 HSCs 与成骨细胞有关（ 2） ，然而后来发现许多HSCs 与窦状小管内皮有关（ 3） 。移植后的造血重建，需要 HSCs 有效地导向到 BM 龛中。多种从细胞分泌到 BM 龛中的细胞因子和生长因子调控着 HSCs 的维持和分化（4 ） 。HSCs也表达一系列黏附受体，接受 BM 中不同类型细胞分泌的配体，使得植入的 HSCs 可以导向和定居（5 ） 。黏附受体表达情况的改变，或其与龛中相应受体之间相互作用的改变，不止会引起 HSC
4、 动员，也会使 HSC 难以维持（6） 。细胞因子 CXCL12 及其 G 蛋白耦联受体（ GPCR）CXCR4，在造血干细胞/ 祖细胞迁移到BM，以及定居于龛的过程中起主要作用（711） 。基于 Mx-cre 技术，将 CXCR4 从成年小鼠HSCs 中条件性删除，显示出 CXCR4 对维持原始 HSCs 很重要（10） 。这一相互作用对于人类及小鼠 HSCs 植入受辐射处理后的宿主体内后，进行导向的过程十分重要（10，11 ） 。由BM 龛细胞产生的一种 CXCL12 细胞因子浓度梯度，吸引着植入的 HSCs 前来，它们首先黏附于内皮并滚动，然后通过穿内皮迁移，穿入组织（12） 。根据表达
5、 CXCL12 的细胞类型，CXCL12 不同地影响 HSCs 的维持，和谱系定型祖细胞的维持（13 ，14） 。尽管人们做了很多工作来评估分泌出来的 CXCL12 的更新与失活，关于 Cxcl12 基因表达调控的方面仍然所知不多。CXCL12 的表达在缺氧条件下升高，这是由 HIF-1 结合在其启动子上所致（15 ） 。诸如 IL-1 好 IL-6 这样的炎症刺激，以一种 CCAAT/增强子结合蛋白（c/EBP）依赖性方式诱导 CXCL12 表达（16） 。另外，Cxcl12 启动子区域，除了别的以外，还含有 Sp1，AP1，NF KB，PARP1 结合位点（17） 。骨形态生成蛋白（BMP
6、s）是中胚层分化的主要调控因子，在造血系统的发育中起重要作用（18，19 ） 。另外，它们在骨组织的形成与动态平衡中起重要作用，这形成了关键性的BM 龛（20） 。BMPs 可以调控出生后时期的骨动态平衡，并调控骨量来影响成年造血过程，这一点虽然已经了解得很清楚，但尚不清楚 BMP-介导的成骨生物学上的变化是否会直接影响 HSPC 的功能。以前，人们发现 TGF- 可以影响基质细胞系中 Cxcl12 的表达（26） 。这里，我们揭示了 BM 龛中，通过 SMAD 依赖性 BMP 信号转导途径调控 CXCL12 的表达，影响了 HSCs 的导向与移植成活，也影响造血祖细胞的动员。MATERIAL
7、 AND METHODS此处暂略RESULTS系统性抑制 SMAD-依赖性 BMP 信号转导途径增强了 HSCs 的导向与移植成活为了评估 SMAD 依赖性 BMP 信号转导途径在成年造血过程中的作用，我们对经亚致死量辐射处理过的 CD45.2 小鼠静注 PBS/NGN。NGN 与 BMPs 结合，抑制其与其受体的结合（34 ） 。大约 50000 个来自 CD45.1 小鼠的 BM 细胞被移植到经处理后的 CD45.2 小鼠中，以评估在 BMP 信号转导途径发生改变后，移植成活方面是否有任何变化（Fig.1A,1B） 。我们观察到移植后第 4，8 及 12 周，在未注射 NGN 的原始受体内
8、的供体源性嵌合现象连续增加 。另外，对继发受体的分析显示，注入 NGN 的小鼠中，长期供体源性的与 BM 的嵌合现象增加了 3 倍。这些研究揭示了 SMAD 信号转导途径的抑制显著增加了 HSCs 的长期群体恢复（repopulation）能力。为了确定注射了 NGN 的小鼠中，HSPCs 的移植成活增加是否是由导向能力增强所致，所有的 BM 细胞或 lin-细胞被注射到受到致死剂量辐射的动物中，移植后 16 小时，定居在BM 内的克隆形成细胞（ CFCs）的总数被统计出来，并与注射的 CFCs 的数量进行比较（Fig.1C ） 。植入的 CFCs 在 BM 中定居的比例，在那些 NGN 处理
9、前的动物中明显更高。换言之，注射 BMP7 而不是 BMP4，会引起植入 HSCs 的导向能力下降。下一步我们检验了注入 NGN 后，在龛内表达的关键造血调控因子相应的表达情况（Supporting Information Fig.1A） 。向小鼠注入 PBS/NGN 后 24 小时，用压碎与胶原酶 处理分离出后肢骨中的 BM细胞。用 MACS 分离的 lin-CD45-BM 龛细胞来做 qRT-PCR 以定量其基因表达情况。在所有被分析的基因中（Cd44 ， Cxcl12， Icam1， Vcam1， Mmp7， Mmp9， Upa， Ang1， Opn， Scf，以及 Ccl2） ，我们发
10、现 Cxcl12 的表达在 NGN 注射后增加了 2 倍（Supporting Information Fig.1A） 。我们重复了这些实验，评估在注射 PBS/BMP7/NGN 之后，除了 Cxcl12 表达之外的SMAD 目标基因的表达，以分析 SMAD 信号转导途径的状态（Fig.1D ） 。SMAD 目标基因Id2， Id3，以及 Runx2 的表达在 BMP7 注入后增高了，而与注射 PBS 的对照组相比，注射NGN 后的小鼠中，这些目标基因的表达下降了，这证实了注射的蛋白质对龛细胞中 SMAD依赖性 BMP 信号转导途径的反应性调控（Fig.1D） 。另外，注入 BMP7 增加了
11、lin-CD45-BM细胞中 SMAD 目标基因的表达，而减少了 Cxcl12 的表达，这与 NGN 注射的结果相反。之后我们测试了注入 DM，一种特异性 SMAD 磷酸化抑制剂（ 35） ，是否会产生类似 NGN 的效果。我们观察到注射 DM 也能引起 lin-CD45-BM 细胞中 Cxcl12 表达的增加（Supporting Information Fig.1B） 。这也伴随着移植后 16 小时内定居在 BM 中的植入 CFCs 比例增加（Supporting Information Fig.1C） 。我们也通过对 BM 血浆的 ELISA 评估了由 BM 龛细胞分泌的 CXCL12
12、蛋白（Fig.1E） 。与基因表达结果一致，NGN 和 BMP7 也影响了 BM 血浆中CXCL12 蛋白的水平。我们没有发现外周血 CXCL12 水平有任何变化（PB; Fig.1F） 。在 BM 基质细胞中抑制 SMAD 介导的 BMP 信号转导途径强化了CXCL12 的表达由于 CXCL12 是已知的最重要的将 HSCs 趋向到龛中的化学因子，我们研究其表达程度的改变是否会引起 HSPCs 向经过 NGN 处理的龛中迁移。我们使用了成熟 BM 基质源性细胞系 ST2 作为离体模型，用小室转移系统（transwell system）测定迁移（Fig.2A） 。我们评估了谱系耗竭的（line
13、age-depleted）BM 细胞（被 PKH-26 标记） ，向 ST2 细胞趋化迁移的过程，这种 ST2 细胞要么受了 NGN 或 DM 处理，要么就没受处理。DM 是一种 BMP 信号转导途径非常强力的小分子抑制剂，通过选择性抑制 BMP 受体来发挥作用。用 DM 抑制 BMP 信号转导途径引起 HSPCs 向 ST2 细胞迁移（Fig.2A） 。增加 NGN 也使得 HSPCs 向 ST2 细胞的趋化过程增强，提示有信号途径的自分泌调节参与进来。由于静注 BMP7 抑制了植入 HSPCs的导向，我们也分析了 HSPCs 向经 BMP7 处理过的 ST2 细胞迁移的可能性。但是，和活体
14、中 BMP7 对 HSPCs 定居产生的作用不同，我们没有发现离体条件下 BMP7 对迁移有任何影响。由于注射 BMP7/NGN 造成 SMAD 信号转导途径改变，并伴有 BM 龛中 Cxcl12 的表达变化。我们检验了经处理的 ST2 中 Cxcl12 的表达是否也有相同的变化。在有 BMP 抑制剂NGN 或 DM 存在的情况下培养两天，ST2 细胞中，Cxcl12 的表达与对照组相比，用 qRT-PCR检测（Fig.2B） 。我们观察到 ST2 细胞中，在 SMAD 信号途径受到 NGN 或 DM 抑制的情况下，Cxcl12 表达情况显著增高，我们测定了那些受 DM 或未受 DM 处理的
15、ST2 细胞的上清液中CXCL12 蛋白的水平，进一步扩展了这些发现（Fig.2C） 。与基因表达的数据一致，我们发现经 DM 处理培养的 ST2 细胞，与对照组相比，CXCL12 的分泌水平增高。这些结果被我们做的荧光素酶启动子试验进一步证实，在该试验中，CXCL12 启动子被复制到 pGL3 载体的荧光素酶基因上游（the CXCL12 promoter was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL3 vector） 。ST2 细胞转染了含有 CXCL12 启动子的载体，然后用双重荧光素酶试验来评估受对照载体处理，或受 DM/N
16、GN 抑制剂处理后荧光素酶的活性（Fig.2D） 。NGN 和 DM 都增强了 CXCL12 介导的荧光素酶表达，不过 NGN 的增强效果要弱于 DM。除了 ST2 细胞，我们还用原始 BM 基质细胞来做 qRT-PCR，评估 Cxcl12 的表达是否受到了 SMAD 信号途径改变的影响（Fig.2E） 。就像对 ST2 细胞的影响那样，用 DM 或 NGN 抑制 SMAD 介导的 BMP信号途径，也诱导 Cxcl12 在原始 BM 基质细胞中表达增加。这些结果揭示了在那些属于BM 龛的细胞中，抑制 BMP 信号途径增强了 Cxcl12 的表达。此外， NGN 在 Cxcl12 表达上的作用提示，SMAD 介导的 BMP 信号途径在基质细胞中确实是活化的，这或是由 FBS 中的BMPs 存在所致，或是由这些细胞中的 BMPs 所致。ST2 细胞中 Cxcl12 的表达受到自分泌形式的调控在我们揭示 ST2 细胞中 SMAD 依赖性 BMP 信号途径的抑制增强了 HSPCs 的趋化并增加了 CXCL12 的产量时，通过增加 BMP7 进行的刺激在离体情况
