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1、 玉米中 SOD 的分离提取及性质研究 学生姓名 王旭学 号 2013213827专业班级 生物工程 13-01 班指导教师 钱鑫华 樊婷婷院系名称 生物与食品工程学院组 员 王旭，崔洪源，戴琦泽，范立峰一，前言SOD 广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD 主要有 CuZn-,Mn-,Fe-SOD 三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。在医药中，SOD 可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老，抗
2、炎，防晒等作用。植物中大蒜的 SOD 含量丰富，所以，本实验研究大蒜中 SOD 的性质，并且确定 SOD 同工酶的类型。根据 SOD 的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法判断同工酶的最适温度，最适 PH，以及双氧水对酶的活力抑制。并采用改进的自氧化法测酶的活力.1，SOD 性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称 SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。SOD 金属蛋白酶，对 pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为 3 种：铜锌超氧化物歧化酶(C
3、uZnSOD)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD) 和铁超氧化物歧化酶(Fe SOD)2、邻苯三酚自氧化法根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每 mg 蛋白质具有的酶活性单位（Umg 蛋白）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：每 mL 样品中的蛋白质 mg 数（mgmL）;每 ml 样品中的酶活性单位数（U mL ）。酶的纯度越高酶的活性也就越高。SOD 酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还原法、化学发光法等。在一般情况下，SOD 酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。利用邻苯三酚在
4、碱性条件下能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在34min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在 325nm 处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用 1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加3、不连续电泳不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连
5、续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标-高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。二，实验试剂玉米，氯仿-乙醇混合液、维生素、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/L PH7.8 磷酸钠、10 mmol/LHCl、 Tris（三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘氨酸。1 2.45mol/LNBT 溶液：称取 200mgNBT 溶于蒸馏水中并定容至 100ml 置棕色试剂瓶中，避光贮存。2. 3.60mol/L PH7.8 磷酸缓冲液（内含 2.
6、8mol/L TEMED 和 2.8 维生素）：在 100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸钠缓冲液中加 0.42mlTEMED 及 1.32mg 维生素 ，置棕色瓶中贮存。3 PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris6.0g,甘氨酸 28.8g，加水至1000ml,用是加水稀释 10 倍。4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液：称取 18.2g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）加 24ml 1mol/L 盐酸，加水至 100ml.5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液:称取 Tris6.0g,加 48ml 1.0mol/L 盐酸溶
7、液 100ml 。6. 以及不同浓度的磷酸缓冲液。0.05mol/L， PH 如下 5.8 6.5 7.0 7.3 7.6 7.8 7.9 8.3三，实验仪器移液管、离心机 5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm 比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等。四，实验内容玉米粗酶液的提取 1、提取：称 15g 左右的玉米粒至于研钵（事先冷藏）中，使细胞破碎，再加入 5ml 0.05mol/l PH7.8 的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏），继续淹没搅拌15min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后 10000r/mi
8、n,离心 10min，弃去沉淀，得蒜的提取液。 2、取出杂蛋白：玉米粒提取物加入 2 倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌 15min，10000r/min 离心 10min,取出杂蛋白，得粗酶液。 3、沉淀 SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,使 SOD 凝聚，10000r/min 离心 10min，得 SOD 沉淀溶于 2ml PH7.8 的磷酸盐缓冲溶液中。SOD 性质的研究 表一邻苯三氛自氧化法测定 SOD 的酶活性： 1、邻苯三氛自氧化速率的测定：取两支试管按表 1 加入 25预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三氛（空白管用 10mmol/l HCL 代替邻苯
9、三氛），迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s 读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化，得出每分钟的自氧化速率。（可增减邻苯三氛自的加入量以控制光吸收值） 表一2、SOD 样液活性的测定 样品管取代自氧化管（表 2）。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三氛。其余步骤同邻苯三氛自氧化速率的测定。表二酶活性的计算：酶活性=( 自氧化速率-样液速率 )/自氧化速率)*(100%)/(50%)*反应液总体积*样液稀释倍数/样液体积 根据上述 SOD 酶活性的测定方法测定在不同 PH 下、不同温度下、激活剂和抑制剂下求出酶活性。做出酶活性
10、和不同 PH 曲线、酶活性与温度曲线、以及在抑制剂条件下酶活力的大小。 不同 PH 对酶活力的影响：首先按下表（表三）加入 PH 分别为 7.1 的 25预热过的缓冲液，注意加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每 隔 30s 读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变 PH 分别为 7.7,8.2,8.6,9.0，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。表三试剂 空白管/ml 自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 310mmol/l HCL 0.015
11、0.0150mmol/l 邻苯三酚 - 0005试剂 空白管/ml 自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 310mmol/l HCL 0015 -SOD 样液 - 00150mmol/l 邻苯三酚 - 0005试剂 空白管/ml 自氧化管 /ml 样品管/mlPH 7.1 50mmol/l Tris-HCL 3 3 310mmol/l HCL 0015 0.01 -SOD 样液 - - 00150mmol/l 邻苯三酚 - 0005 0005不同温度对酶活力的影响: 首先取试管按下表加入 0的缓冲液，然后加入相同温度下的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿
12、中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变温度分别为 25,50,75 ,100。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。表四抑制剂的影响：按下表 25预热过的液体，最后加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。与不加抑制剂的相比较得出结论。表五PAGE 定位染色法鉴定同工酶的类型按配方（表七）在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加
13、一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。凝胶在 30-40放置约 40 分钟-1 小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在 30-40，聚合约 40 分钟-1 小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚） 2、加样：按下表（表八）加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。（Mn-SOD 的活性受氯仿 乙醇的影响，CuZnSOD 和 Fe-SOD 这两种同工酶均对 H
14、2O2 酶感，CuSOD 对 KCN 酶感，MnSOD 不受 CN 的影响）试剂 空白管/ml 自氧化管/ml 样品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 3 310mmol/l HCL 0015 0.01 -SOD 样液 - - 00150mmol/l 邻苯三酚 - 0005 0005试剂 空白管/ml 自氧化管/ml 样品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 3 310mmol/l HCL 0015 0.01 -SOD 样液 - - 00150mmol/l 邻苯三酚 - 0005 000530%H2O2 5 滴 5 滴 5 滴3、表七待各管溶液
15、配置好后，分别取 10ul 加入凝胶的 3 个齿上。3、电泳：SOD 同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。连接电源，调节电流至 15mA，待样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至 20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘 1-2cm 时，关闭电源，电泳结束。4、SOD 活性染色：取凝胶板，采用 SOD 负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色：在 2.4510 3mol/l 氮蓝四唑(NBT)黑暗下浸泡 20 分钟；在 3.610-2mol/l PH7.8 磷酸钠缓冲溶液（内含 2.810-2mol/l 四甲基乙二胺(TEMED)、2810-5mol/l 核黄素）中，在黑暗条件下浸泡 15min；贮液 100ML 溶液中含量pH 凝胶的配置A 1M hcl 48MLTris 36gTemed 0.24mlC Acr 30gBis 0.8gE 核黄素 4mg8.9 分离胶 T=10%A:C:E:H2O=1：3:1:3B 1M HCL 48mlTis 5.9gTEMED 0.46mlD Acr 10gBis 2.5gF 蔗糖 40g6.7 浓缩 T=3.75%B:D:E:F=1:3:1:3电极缓冲液 甘氨酸 28.8g蒸馏水 1L8.3 用时稀释十倍编
