《Ad-hTERT-HSV-tk-GCV系统治疗人膀胱癌裸鼠移植瘤的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Ad-hTERT-HSV-tk-GCV系统治疗人膀胱癌裸鼠移植瘤的实验研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 系统治疗人膀胱癌裸鼠移植瘤的实验研究作者：连文峰，林向阳，张素英，王春仙，杨永安，于洋，宫香宇，陈艳军，张敏【摘要 】 目的 探讨带有人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-tk ）基因的重组腺病毒（ Ad-tk）结合无毒的环氧鸟苷（gancyclovir，GCV）对人膀胱癌的治疗作用。 方法 建立人膀胱癌（人膀胱癌细胞株 253J）BALB/C 裸小鼠移植瘤模型 ,
2、 采用hTERT 为启动子驱动 Ad-HSV-TK 肿瘤局部注射荷瘤小鼠后 ,腹腔注射 GCV 治疗并观察结果。 结果 单纯 Ad-hTERT-HSV-tk 和单纯GCV 对肿瘤生长无抑制或促进作用；而经过 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 治疗的裸鼠，显示出明显的肿瘤抑制作用，其体积显著低于各对照组（P0.01 ） ，其中一裸鼠肿瘤几乎消失，其肿瘤抑制率达 72.5。 结论 异种动物移植 253J 细胞后，Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 系统对体内膀胱肿瘤的生长有明显抑制作用。hTERT 启动子调控腺病毒介导的 HSV-tk/GCV 基因系统能成功靶向性转入人膀胱癌细胞，治疗人
3、膀胱癌效果显著，这为临床上应用自杀基因治疗晚期恶性肿瘤提供了新的思路。 2【关键词】 膀胱癌；基因治疗；重组腺病毒；人端粒酶逆转录酶The animal research of adenoviral mediated HSV-tk/GCV suicide gene system controlled by HTERT promoter on human bladder cancer【Abstract】 Objective To approach the treatment efficiency of replication defective adenovirus carrying HSV/T
4、K gene under control of the human telomerase reverse transcriptase（hTERT） promoter and ganciclovir （GCV） in a mouse xenografts model of bladder cancer. Methods We erect the model of human bladder cancer （bladder cancer cell line 253J）xenografts in BALB/C nude mouse followed by peritoneal injection o
5、f GCV. Results GCV and Ad-hTERTp-HSV-tk alone caused no effect on tumor growth. Therefore Ad-hTERTp-HSV-tk /GCV system was more effectively suppressed on tumor growth of nude mouse .The tumor volume was obviously small as compared to any control group. The tumor was disappeared in one of them. The i
6、nhibition of tumor growth reached 72.5%. Conclusion Ad-hTERT-TK/GCV system is highly efficacious to suppress the 3growth of human bladder cancer in vivo which was injected with bladder cancer cell line 253J. HSV-tk/GCV suicide gene system controlled by HTERT promoter can be selective shifted to huma
7、n bladder cancer cell. And the effect is obvious, so it may be provide a new idea for treating ending malignancy in clinical use.【Key words】 bladder cancer;gene therapy;recombinant adenovirus;hTERTHSV-tk/GCV 系统是肿瘤自杀基因治疗中研究最为广泛的酶前药系统之一14 。端粒酶是目前所见到的特异性较好的一种广泛的肿瘤新标志物。在 90%以上的膀胱癌细胞中可检测到其活性，而在绝大多数正常细胞无活
8、性，这源于其核心成分-人 端粒酶逆转录酶（hTERT ）基因的转录激活5 。hTERT 是端粒酶的催化亚单位，hTERT 的启动子可用于调控治疗基因在肿瘤细胞中的靶向表达。本实验采用 hTERT 驱动 Ad -HSV/TK 基因对人膀胱癌细胞株 253J 进行了体内转染实验，观察对膀胱癌细胞 253J 的生长抑制作用，并对可能的作用机制以及影响因素进行了初步探讨。1 材料与方法41.1 材料 带有 HSV-tk 基因的由 hTERT 启动子驱动的复制缺陷型重组腺病毒 （Ad-hTERT-HSV-tk ）由河北医科大学第二医院泌尿外科提供, 人膀胱癌细胞株 253J 由上海东方肝胆外科医院钱其军
9、博士惠赠, BALB/C 裸鼠，5 6 周龄，共 40 只，雌性，重量1822g。购自中国医学科学院动物培育中心。 GVC 购于 Roche-Syntax 公司 ,培养液 RPMI1640（GIBCO） 、含 10%灭活胎牛血清（fetal bovine serum ，FBS，GIBCO）均购自美国 Invitrogen公司。1.2 细胞培养 体外培养人膀胱癌细胞株 253J，取对数生长期细胞，用 0.25%的胰酶消化，离心后收集细胞。用 PBS 重悬，3000rpm 室温下离心 10min，弃上清。再用 PBS 重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液，浓度为 2107 细胞/ml。1.3 建立膀胱
10、癌裸鼠皮下移植瘤模型 即将膀胱癌细胞用无菌生理盐水配成 2107 细胞/ml 的细胞悬液。在小鼠右前肢腋窝皮下接种 0.2ml 细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况，每周 2 次用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小，2 周左右，待成瘤后分组试验。肿瘤体积计算按公式：体积=长径短径 20.5236。1.4 分组及治疗方法 当肿瘤生长至体积为 100mm3 时，对荷瘤裸鼠进行随机分组，选用瘤体大小一致的裸鼠 40 只，分为 10 组，5每组 4 只。A 组为 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 组：于第 1、5、10 天每只裸鼠肿瘤内注射浓缩病毒液 Ad-hTERT-HSV/tk（1109pfu）0.1ml
11、。第 2 天腹腔注射 GCV100mg/（kgd）15d。B 组为 Ad-hTERT-HSV-tk 组：在裸鼠瘤内注射 Ad-hTERT-HSV-tk，第 2 天腹腔注射 PBS15d，不注射 GCV。C 组为 GCV 组：在裸鼠瘤内注射 PBS，腹腔注射 GCV100mg/（kgd ）15d。D 组为对照组：裸鼠瘤内每天仅注射 PBS。瘤内注射 Ad-hTERT-HSV-tk 时，先穿刺一皮下隧道，然后针刺入肿瘤内, 留针 60s。1.5 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 治疗肿瘤的疗效观察 肿瘤生长抑制的观察：自注射药物开始，每 4 天用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤的体积，描
12、绘肿瘤的生长曲线，共观察 4 周。观察期结束后采用颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖观察瘤体的大体形态，取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。按（1-治疗组重量/对照组重量）100%计算肿瘤生长抑制率。1.6 取膀胱肿瘤组织应用 TUNEL 法检测肿瘤细胞凋亡及免疫组化染色检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达 用图像分析系统测定10 个400 高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占 100 个肿瘤细胞的比例，取其平均值作为凋亡率。采用免疫组化染色法检测，核染色为深棕色为 PCNA 表达阳性细胞，400 高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占 100 个肿瘤细胞的比例，连续观察 10 个视野，取其平6均值作为 PCNA 增
13、殖指数（PI） 。1.7 统计学处理 对实验中所获得的各种数据均采用均数 标准差表示，各组数据之间比较采用单因素方差分析，P0.05） ，根据肿瘤的体内生长曲线，B、C 、D 各组的肿瘤均呈持续快速生长，生长曲线大致相同（P0.05） ；而经过 Ad-hTERT-tk/GCV 治疗的裸鼠，显示出明显的肿瘤抑制作用，其体积显著低于各对照组（P0.01） ，其中一裸鼠肿瘤几乎消失，其肿瘤抑制率达 72.5%。2.2 肿瘤组织的病理切片观察 病理检查发现，B、C 、D 三组镜下 HE 染色见肿瘤为大量瘤细胞组成，排列紧密，间质极少，细胞群边缘不光整，肿瘤血管网络丰富，肿瘤细胞边界不清，细胞形态和细胞
14、核呈多行性，细胞核大深染，核分裂象多见。治疗组：肿瘤细胞呈稀疏分散排列，有片状坏死，肿瘤血管明显减少，组织结构紊乱，多为纤维组织所代替，部分胞浆空泡性变，胞浆淡染，染色质疏松，部分肿瘤细胞核固缩，呈退化表现。72.3 肿瘤组织内细胞凋亡和增殖细胞核抗原的检测结果 仅在Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 治疗组标本中，发现大量的棕色的凋亡细胞，凋亡指数为 1.10.2（%） ，同其他各组相比差异有显著性（P0.05） （图 3） 。在 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 治疗组的肿瘤组织中，仅见孤立的棕色细胞,肿瘤细胞的 PCNA 增殖指数明显减低为 45.69.8（% ） （图 4）
15、。3 讨论我们将 253J 细胞在裸鼠体内成瘤，Ad-hTERT-HSV-tk 活体应用时直接瘤内注射，结果发现在 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 作用下，膀胱癌细胞形成的肿瘤其生长明显受到抑制。治疗组的瘤重和体积，明显低于各对照组。组织病理提示治疗后癌细胞和肿瘤血管网络明显减少，癌细胞的细胞核胞浆呈明显退化。这些结果表明 Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 系统在体内具有显著的抑瘤效果，从而证明了Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 系统用于肿瘤靶向基因治疗的可行性。除了 HSV-tk/GCV 系统对肿瘤的直接杀伤作用,还可能与凋亡机制6 、肿瘤血管7等有关。有实验表明裸鼠也存在明显的远处旁观者效应,可能由细胞、巨噬细胞、胸腺外成熟的细胞或细胞凋亡产生的一些可溶性因子介导8 。Ritz 等9 在 HSV-TK基因治疗肿瘤的体内实验中,观察到人端粒酶逆转录酶启动子调控的8复制缺陷型腺病毒 Ad-hTERT-TK 具有良好的肿瘤细胞内特异性表达能力，它可以选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中复制。本实验也发现 253J 细胞在荷瘤鼠体内呈浸润性生长，繁殖速度较快，Ad-hTERT-HSV/tk 的瘤内注射，配合全
