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1、氨磺必利是一种有效的 5-HT7 拮抗剂与其体内抗抑郁作用有关Abbas AI, Hedlund PB, Huang XP, Tran TB, Meltzer HY, Roth BL摘要背景 在欧洲许多国家，临床上氨磺必利已被批准用于精神分裂症的治疗，而在意大利，治疗适应症还包括：恶劣心境和轻度抑郁障碍。诸多临床研究结果提示，氨磺必利能有效治疗重性抑郁障碍。一直以来，大家认为氨磺必利抗抑郁、抗精神病的核心机制是其能够调节多巴胺功能，可选择性拮抗 D2/D3 受体。目的 本研究的目的旨在探索氨磺必利的抗抑郁效应是否受与其它受体相互作用的脱靶效应所调节。材料与方法 我们完成了如下实验：（1）氨磺必
2、利对大量中枢神经系统分子靶点的药理学分析；（2）寻找 5-HT7a 受体的高效亲和拮抗剂，继而观察氨磺必利对野生型和 5-HT7 受体敲除小鼠的抗抑郁疗效。结果 本研究发现，氨磺必利是一种有效的 5-HT7a 受体竞争性拮抗剂，并与其它的分子靶点没有相互作用，这点也许能够解释该药在体内抗抑郁作用的机制。特别是与野生型同胞不同之处在于：在悬尾实验和强迫游泳实验这两种经典的抑郁症啮齿类动物模型中，氨磺必利对 5-HT7 受体敲除小鼠无治疗效应。结论 氨磺必利的抗抑郁作用可能与 5-HT7a 受体拮抗有关，而并非氨磺必利对 D2/D3 受体拮抗所致。关键词： 氨磺必利；5-HT 7；5-HT 7 受
3、体拮抗剂；抗抑郁药物；非典型抗精神病药物；DAN2163 前言氨磺必利是一种苯甲酰胺衍生物。作为选择性 D2/D3 受体拮抗剂，它起初被开发用于治疗精神分裂症（Perrault et al. 1997） 。大量的临床试验证明，与其它抗精神病药物相比，氨磺必利治疗精神分裂症显示出疗效相当或更为有效（Racagni et al. 2004） 。荟萃分析结果显示，氯氮平、氨磺必利、利培酮、奥氮平比第一代（典型）抗精神病药物和其它非典型抗精神病药疗效更显著（Davis et al. 2003; Leucht et al. 2009） 。在临床实际使用过程中发现，氨磺必利 EPS 发生率较低，这也是其最
4、类似于一种非典型抗精神病药物的地方（ Leucht et al. 2002） 。但与利培酮及典型抗精神病药物类似，氨磺必利由于有较强的 D2/D3 拮抗特作用，致使血清催乳素水平明显升高（Wetzel et al. 1998） 。氨磺必利表现出 D2 受体高亲和力和 5-HT2A 低亲和力，这种药理学特性使之类似于典型抗精神病药物，然而在治疗方面，它却更像一种非典型抗精神病药物。研究显示，氨磺必利能够改善精神分裂症患者的注意力、执行功能、工作记忆、总体认知指数以及陈述性记忆（Deeks and Keating 2008; Mortimer et al. 2007） 。但可能会损害正常人群的识别
5、记忆功能（Gibbs et al. 2008; Mortimer et al. 2007） 。有趣的是，在治疗精神分裂症和其它精神障碍的过程中，氨磺必利表现出抗抑郁效应（Kim et al. 2007; Montgomery 2002） 。在意大利，氨磺必利已获准用于治疗恶劣心境，被认为是一种高效抗抑郁剂（Montgomery 2002） 。事实上，Lecrubier 等使用蒙哥马利和阿斯伯格抑郁症评估量表，对氨磺必利和丙咪嗪治疗恶劣心境、重性抑郁障碍进行了疗效比较，结果显示两者疗效相当（Lecrubier et al. 1997）。另外一项研究比较了氨磺必利和氟西汀治疗重性抑郁障碍、恶劣心境
6、的疗效，结果显示两组等效（Smeraldi 1998），而且两组的有效率、不良事件数量以及脱落率也相当。实际上，至少已有 6 项临床研究表明，氨磺必利治疗恶劣心境和/或重性抑郁障碍的疗效与阳性对照药物类似（Racagni et al. 2004）。学者们普遍推测，对多巴胺信号的调节是氨磺必利抗抑郁效应的核心基础，这种推论主要源于该药能选择性拮抗 D2/D3 受体。事实上，多巴胺系统在抗抑郁效应中似乎在扮演一定的角色。许多不同种类的抗抑郁药物，包括氟西汀、氟伏沙明和去甲丙咪嗪，均能够增加大鼠前额叶皮质细胞外的多巴胺含量（Tanda et al. 1994; Jordan et al. 1994;
7、 Bymaster et al. 2002）。另一方面，舒必利另一种苯甲酰胺衍生物，也能选择性拮抗 D2/D3 受体，当将其注入强迫游泳实验的大鼠双侧伏核，而非尾状壳核时，会显著降低去甲丙咪嗪的抗抑郁效应（Cervo and Samanin 1987）。尽管舒必利在人体上表现出抗抑郁作用，但与阿米替林相比却弱很多（Drago et al. 2000）。总之，除了氨磺必利，其它苯甲酰胺类药物与 5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）以及三环类抗抑郁药相比，未被确认具有抗抑郁效应。尽管有较为确切的证据表明，某些抗抑郁药物能够调节多巴胺系统，但除了上述一些现象学数据，并无直接证据显示选择性多巴胺受体拮
8、抗剂（如氟哌啶醇）在单一治疗时具有抗抑郁效应，而且在该种情况下，其它靶点并未受到影响。另外，阿立哌唑被批准用于抑郁症的联合治疗，但它对抗抑郁剂起效过程中所涉及到的许多生物胺受体和转运蛋白均无靶标作用（Shapiro e al. 2003）。部分研究显示，抗抑郁药物联合奥氮平能够有效治疗难治性抑郁或双相抑郁障碍（Deeks and Keating 2008）。另外，喹硫平通过其主要代谢产物N-脱烃喹硫平（去甲喹硫平） 有效抑制去甲肾上腺素转运蛋白，从而发挥抗抑郁效应，这个过程并未包含对多巴胺受体的任何直接作用。因此，我们试图验证氨磺必利的抗抑郁效应是否源于其对 D2/D3 受体的拮抗。通过筛选氨
9、磺必利在中枢神经系统中的大量靶点，旨在分析和识别其抗抑郁作用的机制。材料和方法放射性配体结合分析放射性配体购于 Perkin-Elmer 及 GE 医疗保健中心。使用转染或稳定表达的细胞膜进行竞争性结合分析，其详细制备过程如既往研究所描述（Shapiro et al. 2003; Roth et al. 2002），且供在线查询（http:/pdsp.med.unc.edu）。表 1 罗列了关键信息，例如放射性配体成分和浓度、温育缓冲液和温育时间，额外信息可在线查询（ http:/pdsp.med.unc.edu/UNC-CH%20 Protocol%20Book.pdf）。Schild 分析
10、稳定表达 5-HT7a 受体的细胞置于白色 OptiPlate-96 孔板（Perkin-Elmer）中培养过夜，使用含 1%透析胎牛血清的 DMEM 培养基，每孔 10,000 个细胞。然后代之以测定培养基（DMEM 培养基含 2mM 异丁基甲基黄嘌呤以及 10 mg/100 ml 抗坏血酸）在 37预温育30 分钟；上述测定培养基中每孔 5L 的氨磺必利按 10 倍稀释成 7 种终浓度（0、1、3、10、30、100 和 300nM）；5 分钟后，每孔 5L 的 5-HT 按 10 倍稀释成 8 种终浓度（0、3、10、30、100、300、1000 和 3000nM）。该分析用于在没有氨
11、磺必利以及不断增加氨磺必利的环境中，绘制 5-HT 剂量- 反应曲线。反应过程在 37条件下进行 30 分钟。使用 GE 公司的 HitHunter cAMP XS 试剂盒测定 cAMP 含量，方法同使用说明书。简言之，在 30 分钟反应的终末加入 cAMP 抗体，之后再立即加入 Galacton-Star、Emerald-II、裂解液和 cAMP XS+ED 试剂以 1:5:19:25 的比例配制成的混合液。室温温育 1 小时后加入 cAMP XS+EA 试剂，然后置于室温温育 1 小时。使用标准 -粒子计数器读取发光信号，并采用微软 Excel 以及科学图形计算软件 Graphpad Pr
12、ism 进行数据处理。在 Graphpad Prism 中，球形拟合与 Hill 方程结合的改良 Gaddum/Schild 模型（Motulsky and Christopoulos 2004） 。残差平方和的 F 检验用于判断 Schild 和 Hill 斜率是否显著不同于整体。实验动物实验动物为 1012 周的雄性 5-HT7-/-小鼠及其 5-HT7+/+雄性同胞对照。 5-HT7-/-小鼠品系的来源在既往研究已有描述（Hedlund et al. 2003）。本研究所用之小鼠在 C57BL6J 的背景下至少回交 16 代。所有行为学实验始于 09:00AM。小鼠处于 24 小时昼夜循
13、环中（白天06:00AM 开始，18:00PM 结束），自由进食进水。所有的实验均遵循美国国立卫生研究院颁布的实验动物照护与使用指南，并获得斯克利普斯研究机构动物照护与使用委员会的批准。实验中尽量减少实验用动物数量，并减轻其痛苦。悬尾实验悬尾实验的步骤参考既往研究（Hedlund et al. 2005）。用黏带将小鼠的尾部固定在离台面50cm 的金属杆上。为便于与既往研究进行比较，实验持续 6 分钟，在后 4 分钟计算小鼠不动时间。不动定义为没有任何肢体或躯干运动，但应排除呼吸运动。强迫游泳实验强迫游泳实验的步骤同既往研究所描述（Hedlund et al. 2005）。将小鼠轻轻放在一个直
14、径16cm，高度 25cm 的圆形塑料水缸里，水缸中注入 25C 洁净水至水深 10cm。实验持续 6分钟，最后 4 分钟计算小鼠不动时间。不动定义为在水中没有任何水平或垂直运动，除外小鼠为将头部保持在水面以上而产生的小幅度运动。每只动物进行实验前均会换水。 药物治疗悬尾实验和强迫游泳实验前 30 分钟进行腹腔内注射。氨磺必利购自于 Sigma-Aldrich 公司。将药物溶解于以 0.9%NaCl 溶液配制成的 50mM 酒石酸中，注射的总体积为 0.2ml。溶媒作为空白对照。数据分析所有数据以均数标准误（SEM）来表示。基因型和/或药物治疗之间的差异采用双因素方差分析，基因型和药物治疗各作
15、为一个因素。方差分析之后采用 Bonferroni 法校正。使用GraphPad Prism 软件包进行统计学分析； P0.05 为差异具有统计学意义。结果氨磺必利对人 5-HT7a 受体具有高亲和力为明确氨磺必利抗抑郁作用的药理机制，我们采用受体组分析方法筛选了大量潜在靶点（Armbruster and Roth 2005; Table 1），并证实氨磺必利是一种有效的选择性作用于D2/D3受体的药物。氨磺必利对这两种受体的抑制常数 Ki分别为（31）nM和（3.50.5）nM。然而该药物对于另外两种我们以前尚未确认的靶点也有较高的亲和力，分别是5-HT 2b和5-HT 7a受体。氨磺必利对
16、5-HT 2b受体的抑制常数K i为（131）nM，与氚 麦角酸二乙胺（ 3HLSD）竞争结合 5-HT7a受体的抑制常数K i为（11.5 0.7）nM ，而 3HLSD与5-HT 7a受体的平衡解离常数为6.6nM（Shen et al. 1993; Roth et al. 1994; Fig.1）。另外，氨磺必利对h5-HT 1A受体以及对其它与抗抑郁药物药理机制有关的分子靶点亲和力低（Roth et al. 2004）。氨磺必利是一种有效的人 5-HT7a 受体拮抗剂最初的筛选证实了氨磺必利对人 5-HT7a 受体具有高亲和性。已知啮齿类动物和人类具有多种 5-HT7 受体的剪接变异体，但是 5-HT 对它们的亲和力和效能却没有差别。在大鼠体内，迄今为止最常见的亚型是 5-HT7a（Heidmann et al.1998）。鉴于药物对不同的 5-HT7剪接变异体具有一致的药理学特性，于
