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1、1酶法合成芥酸海藻糖酯的分离纯化与表征王海霞 1,2，李舒生 1,2，贾承胜* 1,2，张晓鸣 1,2，冯骉 1,2(1. 食品科学与技术国家重点实验室, 江南大学, 江苏 无锡 214122; 2. 江南大学食品学院, 江苏 无锡 214122)摘 要 ：脂肪酶催化合成芥酸海藻糖酯产物中可能存在单酯和二酯。采用薄层层析(TLC)和硅胶柱层析分离纯化反应完成液，然后用高效液相色谱(HPLC)、液质谱(HPLC-MS)和核磁共振(NMR)法鉴定了纯化组分的分子结构。TLC 分离芥酸海藻糖酯的最佳条件：点样量2 l，以氯仿 /甲醇(4:1, V/V)展开约 30 min，然后用 5%硫酸乙醇溶液喷
2、雾、120显色 20 min。硅胶柱层析分离芥酸海藻糖酯的适宜条件：5 ml 反应液上 12 mm 600 mm 硅胶(100200 目) 层析柱，流动相为氯仿/ 甲醇(4:1, V/V)，流速 80 ml/h，按 1 管/200s 收集洗出液。两种分离组分分别为 6-O-芥酸海藻糖酯和 6,6-O-芥酸海藻糖二酯。关键词：芥酸海藻糖酯；芥酸海藻糖二酯；薄层层析；硅胶柱层析Enzymatic Synthesis, Separation and Characterization of Erucoyl TrehalosesWANG Hai-Xia1,2, LI Shu-sheng1,2, JIA
3、Cheng-sheng*1,2, ZHANG Xiao-ming1,2, FENG Biao1,2(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)Abstract: Erucoyl trehaloses which were synthesized using immobilized l
4、ipase may contain monoester and diester. The reaction mixture were separated and purified by the thin layer chromatography (TLC) and silica gel column chromatography, then the purified products were analyzed by HPLC, HPLC-MS, and NMR. The optimum conditions for TLC were confirmed: 2 l of the reactio
5、n mixture were applied to silica gel G plates, developed by chloroformmethanol (4:1, V/V), and then detected by spraying with 5% of sulfuric acid in ethanol and heated at 120 oC for 20 min. The optimum conditions for silica gel column chromatography were: 5 ml of the reaction mixture was applied to
6、12 mm600 mm silica gel column (100200 mesh) and chloroform-methanol (4:1, V/V) was used as mobile phase, whose flow rate was 80 ml/h, the eluent of 1 tube/200s was collected. The purified products were 6-O-erucoyl trehaloses and 6,6-O- erucoyl trehaloses.Key words：erucoyl trehaloses, dierucoyl treha
7、loses, TLC, silica gel chromatography基金项目: 江苏省自然科学基金项目 (BK2008100)；国家863 计划项目 (2006AA10Z312)。* 通讯作者: 贾承胜(1968-)，男，安徽太湖人，理学博士，副教授，主要从事食品化学研2究。Email: 海藻糖是 由 两 个 葡 萄 糖 分 子 以 ,1,1-糖 苷 键 构 成 的 非 还 原 性 糖 ，广泛存在于自然界中许多动植物和微生物体内 1,2，随着工业化海藻糖年产量的不断增加，其低甜度、稳定性、安全性、抗腐蚀性，抗肿瘤活性等独特的生物学性质为 人 日 渐 重 视 3,4， 在食品、化工、医药、
8、化妆品工业中的应用日趋广泛 4,5。市场的需求和发展推动其应用范围的拓展和技术的革新。近年来，各类海藻糖衍生物产品不断上市，其中，海藻糖酯在食品加工中具有很多优越性质，深受市场青睐，因而被大量研究和制备 4,8。目前，糖酯类非离子型表面活性剂的合成多采用化学法，但化学法常伴随副反应，产物成分复杂，而酶法反应条件温和、立体选择性强、产物分离纯化简单，应用前景较之广阔 6-9。尽管市场上已出现工业化的饱和脂肪酸糖酯，但有关海藻糖不饱和酸酯的合成却鲜有报道，尤其是海藻糖长链不饱和脂肪酸酯的制备还未见报道。芥酸是顺式-13- 二十二碳烯酸，芥酸海藻糖酯酶促合成反应产物是芥酸海藻糖单酯、二酯和多酯的混和
9、物，故产物的有效分离是制备不同酯化度的芥酸海藻糖酯的基础。薄层层析法(TLC)具有分离能力强、快速、灵敏度高和显色方便等优点，适用于多组分、含量少的复杂样品分析，但不能连续操作。硅胶柱层析既具有 TLC 分离的优点，又能适用于较大量样品的连续分离和纯化。本实验首先探索 TLC 分离海藻糖糖芥酸酯的最佳条件，并将之应用于产物的硅胶柱层析分离，然后用高效液相色谱、质谱、红外光谱和核磁共振对其纯度和结构进行分析表征，为规模化生产和研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 原料和试剂固定化脂肪酶 (Novozym435)：诺维信（中国）生物技术有限公司； 1/16分子筛（3A）：上海恒业分子筛有限公司；
10、硅胶G (分析纯)：青岛海洋化工厂；海藻糖：日本林原株式会社；芥酸：四川西普化工股份有限公司；叔丁醇、三氯甲烷、甲醇( 分析纯，色谱纯)和硅胶(分析纯，柱层析用)：中国医药集团上海化学试剂公司。1.2 仪器SHZ-88型台式水浴恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂；扩口层析柱：上海锦华层析设备厂；Waters1525高效液相色谱仪和Waters2420蒸发光散射检测器：Waters中国有限公司；Agilent1100型高效液相色谱仪：美国 Agilent公司；3WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS型质谱仪：美国 Waters公司；AVANCE III 400MHz核磁共振仪：瑞
11、士Bruker 公司。1.3 实验方法1.3.1 芥酸海藻糖酯的脂肪酶催化合成方法取1.5 mmol海藻糖、 6 mmol芥酸、8 g 3A 1/16分子筛、1.5 g 脂肪酶和100 ml叔丁醇于具塞试剂瓶中55下水浴振荡(150 r/min)反应24 h。1.3.2 芥酸海藻糖酯的薄层层析(TLC)分离方法将硅胶G用约3倍质量的水调成均匀的糊状，倒于60 mm120 mm层析板上，制成厚度约2 mm的均匀的薄板，自然晾干后110 活化1 h，置于干燥器中备用。用10 l微量进样器取5 l反应液或直接用点样毛细管取反应液点于薄板的近底端。用三氯甲烷/甲醇(8:1或4:1，V/V)展开15 m
12、in，然后用5%硫酸乙醇溶液喷雾，待晾干后放于烘箱中120 显色20 min。1.3.3 芥酸海藻糖酯的柱层析分离方法芥酸海藻糖酯酶促反应结束后，反应液用滤纸过滤，除去其中的分子筛和酶(均回收 )，用旋转蒸发器将溶剂叔丁醇蒸干，加入5 ml 三氯甲烷溶解后上硅胶层析柱( 硅胶 100200目，12600 mm玻璃柱)分离。流动相为三氯甲烷/ 甲醇(4:1,V/V)，流速为 80 ml/h，按1管/200 s收集洗出液。洗出液经TLC检测后，分段收集相应组分。将收集的组分旋转蒸发除去洗脱剂，所得固体产品放入50的真空干燥箱中干燥至恒重。1.3.4 芥酸海藻糖酯的 HPLC 分析将约1.0 mg样
13、品或 0.5 ml反应液，溶于10 ml色谱甲醇中，用0.45 m的滤膜过滤后，取10 l滤液上色谱柱分析。色谱条件：Zorbax SB-C18 (5 m, 250 mm 4.6 mm i.d)色谱柱，流动相为甲醇：正己烷 (90:10，V/V)，流速1.0 ml/min，柱温30，漂移管温度 40，检测器ELSD 2420。1.3.5 芥酸海藻糖酯的 IR 分析样品的IR光谱采用TMS 法，扫描 64次，分辨率为4 cm -1。1.3.6 芥酸海藻糖酯的(HPLC-MS)分析样品用色谱纯甲醇溶解，然后进行HPLC-MS分析。质谱条件：离子方式为ESI+；毛细管电压为3.5 kV ；锥孔电压为
14、20 V；离子源温度为100 ；脱溶剂温度为250；质量范围为 501000 m/z ；光电倍增器电压为700V ；分析真空度为2.6 10-5 mBar；以N 2为载气，气体流速为50 l/h。色谱条件：检测器：WATERS ACQUITY PDA；分析柱：BEH C18 2.1100 mm 1.7 m；流动相：纯甲醇；柱温：45C；检测波长：200-750 nm；流速：0.3 ml/min ；进样量：5 l。41.3.7 芥酸海藻糖酯的核磁共振(NMR)分析方法以四甲基硅为内标、氘代甲醇为溶剂， 1H NMR 和 13C NMR 在40分别采用400 MHz 和 100 MHz扫描。2 结
15、果与讨论2.1 芥酸海藻糖酯的 TLC 分离影响TLC分离效果的因素主要有展开剂的极性、吸附剂的活性和被分离物质的极性。待分离组分芥酸海藻糖酯的极性和硅胶的吸附能力都是恒定的，因此主要通过改变展开剂的极性来提高组分的分离效果。不同展开剂对芥酸海藻糖单酯和二酯的TLC比移值(R f)的影响见表1。表1 展开剂组成对芥酸海藻糖酯比移值的影响Tab.1 Effect of developing solvent on the Rf values of TLC for erucoyl trehalosesRf糖酯 氯仿/ 甲醇 (8:1, V/V) 氯仿/ 甲醇 (4:1, V/V)芥酸海藻糖单酯 0.
16、12 0.40芥酸海藻糖二酯 0.55 0.95由表1可知，改变展开剂的组成可改变组分的比移值，这是由于芥酸海藻糖单酯和二酯分子的极性不同导致在氯仿和甲醇的溶解度不同，从而具有不同的分配系数。可知，当氯仿与甲醇的体积比为8:1时，芥酸海藻糖单酯和二酯的 Rf分别为0.12和0.55，而在4:1时，芥酸海藻糖单酯和二酯的 Rf分别为0.40和0.95，差异都非常明显，即该两种展开剂组成都可将芥酸海藻糖单酯和二酯明显地分离。2.2 芥酸海藻糖酯的柱层析分离TLC分离方法不能适用于较大批量物料的分离和产品的制备。柱层析的分离原理与TLC相同，用薄层层析法探索柱层析分离纯化条件，是实验室的常规方法。柱层析采用溶剂洗脱的方式对产品进行分离纯化，可对物料进行连续化分离来制备较大量的不同酯化度的芥酸海藻糖酯。由于采用薄层层析法对产物芥酸海藻糖酯进行分离分析时，在所选用的展开条件下获得了较好的分离效果，因此，将薄
