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1、1大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的研究【关键词】 鬼针草；,总黄酮；, 大孔树脂摘要：目的研究大孔吸附树脂富集纯化鬼针草总黄酮的最佳工艺条件及参数。方法采用不同浓度的乙醇梯度洗脱,以紫外分光光度法测定鬼针草总黄酮收率和纯度为指标。结果实验条件下，采用D301 型大孔树脂进行吸附,20%乙醇 100 ml 洗脱，经大孔树脂处理后浸膏的总黄酮含量可达 60%以上。结论 该法可为鬼针草新制剂的研制与生产提供原料药。关键词：鬼针草； 总黄酮； 大孔树脂Study on the Isolation and Purification of Total Flavonoids from Bidens bip
2、innataL. with Macroporous ResinAbstract：ObjectiveTo explore the optimal purification condition of total flavonoids from Bidens bipinnata L. with macroporous resion.MethodsGradient elution was used to elute the components absorpted on macroporous resin guided by the isolation-purification degree and
3、the recovery rate.ResultsThe content of total flavonoids in obtained 2ointment could reach 60% under the condition that D301 type macroporous resin was used as absorption agent and 100 ml 20% ethanol as elution agent.ConclusionThe method appeared to be feasible to isolate and purify total flavonoids
4、 from Bidens bipinnata L.Key words：Bidens bipinnata L.; Total flavonoids; Macroporous resin 鬼针草为菊科植物鬼针草的全草，具清热解毒、散瘀消肿之功效1 ，药理和临床报道对原发性高血压有明显疗效，其降压有效成分主要为黄酮类化合物2 。目前国内上市的有关鬼针草提取物的制剂主要有鬼针草颗粒剂、悦年片、悦年茶等，鬼针草药源充足，价格低廉，开发前景广阔。本实验采用大孔树脂对鬼针草总黄酮进行了分离纯化，工艺简单，切实可行，可为含鬼针草新制剂的研制与生产提供原料药。1 器材UV757CRT 紫外可见分光光度计 (上海
5、分析仪器总厂)；电子精密天平（奥豪斯国际贸易有限公司） 。鬼针草 Bidens bipinnata L.购自山东建联中药店，经该店姚庭芝主任药师鉴定，芦丁对照品购自3中国生物制品检定所，大孔树脂分别购于天津南开大学、成都晨光化工研究院及日本三菱公司。所用试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 鬼针草总黄酮的含量测定2.1.1 标准曲线制备精密称取经五氧化二磷干燥恒重的芦丁对照品 7.00 mg，30%乙醇溶解并定容至 25 ml，即得每毫升含无水芦丁 0.28 mg 的芦丁对照品溶液。分别精密量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml 芦丁对照品溶液置于 10 ml容量瓶中各加
6、 30%乙醇至 1 ml，加入 5% NaNO2 0.5 ml 放置 6 min 后再加入 10% Al(NO3)3 0.3 ml，摇匀放置 6 min 后加入 4% NaOH 3 ml，摇匀放置 15 min 在 510 nm 处测定。以相应试剂做空白分别测定吸光度，以吸光度对浓度进行回归，绘制标准曲线，回归方程：Y=2.376X，r=0.999 7。2.1.2 鬼针草药材总黄酮的含量测定 精密称取鬼针草 3.000 g，加入 60%乙醇 100 ml，置沸水浴中回流 1 h，冷却，过滤，用60%乙醇 50 ml 洗涤，移液至 250 ml 容量瓶，用 60%乙醇定容至刻线，精密量取鬼针草溶
7、液 1.0 ml，至 10 ml 刻度试管中，按标准曲线制备项下方法测定含量，鬼针草中总黄酮的含量4（17.250.59） mgg1（n=4 ） 。2.2 大孔树脂纯化工艺的考察2.2.1 大孔树脂的预处理将树脂装入吸附柱中，并保持 95%乙醇面高出树脂表面浸泡。95%乙醇洗涤树脂层，至流出液加蒸馏水不呈白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味即可。用后的树脂以 95%乙醇洗涤至洗脱液近无色，再用蒸馏水洗涤树脂层至无醇味，必要时用 12 倍树脂体积的 4% a溶液洗涤树脂层，而后用蒸馏水洗至 pH 为 7，即可进行下一周期的使用。2.2.2 洗脱溶剂的确定取处理好的大孔树脂 10 ml 填充于 2 cm
8、20 cm 的柱内 ，将鬼针草水提液( 相当于原生药 0.5 gml1)1.6 ml 上柱， 控制流速 2.5 mlmin1，分别用 60，60，60 ， 60，60 ，90，90 ml，浓度为10%，15%，20%，25%，30%，40%的乙醇溶液进行梯度洗脱，每隔 15 ml 收集 1 次，摇匀，各取 1 ml 按标准曲线制备项下制备样品，510 nm 处测吸光度。结果见图 1。结果表明，100 ml 10 %15%的乙醇即可将吸附在树脂柱上的鬼针草总黄酮洗脱完全，故本实验选用 20%乙醇 100 ml 进行洗脱。2.2.3 上样量考查分别取相当于 0.05，0.1 ，0.5，1.5，3.
9、0 g 鬼针草药材的水提液(相当于原生药 0.5 gml1)，加至5预先处理好的树脂柱上 ( 2 cm10 cm) ，控制流速进行吸附。用100 ml 20%乙醇洗脱。洗脱液依次用水稀释 1，5，10，10 ，10倍后依标准曲线项下处理并测定。结果见表 1。2.2.4 分离的鬼针草总黄酮纯度考察取鬼针草药材 2.50 g，加 8 倍量水加热回流提取 3 次， 1 h/次，合并滤液，水浴浓缩至5 ml(相当于原生药 0.5 gml1)，备用，测得总黄酮含量为 8.5 mgml1。取该鬼针草水提液 3 ml，加于( 2 cm10 cm)大孔树脂柱上。收集洗脱液匀作两份，一份依标准曲线测定总黄酮的含
10、量，另份水浴蒸干后于 105干燥 3 h，测定干膏收率，计算总黄酮的纯度。结果见表 2。图 1 鬼针草中总黄酮梯度洗脱曲线图（略）表 1 上样量对吸附效率的影响（略）*相当于原生药；n=2 结果显示，该实验条件下，鬼针草水溶液最大上样量相当于原生药 1.5 g。从表 2 可看出 ，经大孔树脂处理后的总黄酮含量可达 60%以上，且具有良好的重现性。表 2 总黄酮纯度测定结果（略）63 结论实验中曾对 SP70，D301 等多种型号的大孔树脂进行考察，发现 D301 的吸附分离效果较好。通过对影响大孔树脂吸附及解吸的各种因素系统研究，最后确定了本实验条件下分离鬼针草总黄酮的最佳工艺为：采用 D301 型大孔树脂，上柱量相当于原生药 1.5 g，用 20%乙醇 100 ml 进行洗脱。经过 D301 树脂处理后，使经树脂处理的鬼针草水提液较未经树脂处理的水提取液出膏率显著降低，所得的固体浸膏中总黄酮含量显著提高，说明 D301 树脂对鬼针草中总黄酮有很强的吸附能力。该工艺有效地分离纯化了鬼针草总黄酮，去除了杂质，可为鬼针草新制剂的研制与生产提供原料药。参考文献：1 江苏新医学院. 中药大辞典（下册） M.上海：上海科技出版社，1986：1694.2 周志彬 .悦年片的疗效观察J.中国中药杂志，1989，14 （ 4）：52.
