二甲双胍对糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用

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1、1二甲双胍对糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用【摘要】 目的 探讨二甲双胍(MT)对 2 型糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用。方法 雄性 SD 大鼠 45 只，高脂高糖喂养 6 周后，予以链脲佐菌素(STZ)35mg/kg 腹腔注射制备 2 型糖尿病动物模型，随机分为对照组(CG)、单纯糖尿病组 (DG)、小剂量 MT 干预组(SM， 100mg/kgd 灌胃)及大剂量 MT 干预组 (LM，300mg/kg.d灌胃)，灌胃 12 周后，血清检测胰岛素 (INS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CH)及游离脂肪酸(FFA)，心肌匀浆检测超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛 (MDA)水平，应用

2、免疫组织化学方法测定核因子(NF-B p65)及环氧化酶-2(COX-2) 在心肌中的表达，并观察各组心肌细胞超微结构变化。结果 1)与对照组比较，DG 组体重明显减轻，血糖、心脏质量指数、INS、TG 、T-CH 及 FFA 明显升高(P0.01)；应用 MT 治疗后体重无明显增加，INS 有所下降，心脏质量指数、血糖、TG 及 FFA 明显降低(P 0.01)；DG 组心肌组织 MDA 明显升高，SOD 明显降低(P0.01) ，MT 治疗后上述指标明显改善；2)超微结构观察单纯糖尿病组肌丝结构明显紊乱，典型肌小节结构消失，线粒体肿胀、间质纤维增生，微血管内皮细胞肿胀等表现，而SM 及 L

3、M 组可见组织结构有所改善； 3)对照组心肌 NF-B p65 及COX-2 只有少量表达，单纯糖尿病组表达量明显增多 (P0.01)，MT 治疗后表达量明显减少(P 0.01)。结论 MT 对糖尿病心肌病变具有保护作用，可能与其减弱脂质的过氧化反应，减少 NF-B 及2COX-2 的表达有关。 【关键词】 二甲双胍；糖尿病大鼠；心肌；抗氧化Obstract： Objective To explore the protective effect and investigate anti-oxidative stress mechanism of metformin on diabetic my

4、ocardial damage in rats. Methods The model of diabetes in 45 male SD rats was establised through intraperitoneal injection streptozotoch(STZ) 35mg/kg after six weeks by feeding high fat and high glucose food. 45 rats were randomly divided into control group group(CG)、Diabetic group(DG)、small dose me

5、tformin group(SM,intragastric administration with metformin 100mg/kgd）and large dose metformin group(LM, intragastric administration with metformin 300mg/kg.d ).All groups was taken blood sample to detecte insulin 、blood fat and free fatty acids and prepared myocardium homogenate to detecte activity

6、 of superoxide dismutate (SOD) and malondialdehyde(MDA) and analyze the express of NF-B p65 and COX-2 in myocardium by immunohistochemical analysis,observe myocardial 3ultrastructure at the end of 12 weeks. Results 1)compared with the control group,body weight decreased significantly and blood gluco

7、se 、heart index 、insulin、 cholesterol、triglyeride and free fatty acids in DG group increased significantly（P 0.01）. Compared with DG group, the level of insulin , heart index 、blood glucose、triglyeride and free fatty acids were cut down significantly after treatment with large or small dose metformi

8、n（P0.01）.MDA increased and SOD deceased in myocardium tissues of diabetic group and the difference had significant difference compared with the control group（P0.01）. 2)Myocardial ultrastructure was normal in the control group,myoneme arranged disordered,the structure of typical sarcomere disappeared

9、, mitochondrium intumesced,interstitial substance fiber hyperplasy,capillary vessel endothelial cell swelled in DG group.Myocardial ultrastructure improved slightly in rats of SM and LM groups. 3)NF-B p65 and COX-2 had a small quantity to present in the myocardium tissue of control group,while the q

10、uantity increased obviously in the diabetic group.The level of it in the group of treatment was significant lower than that in the diabetic group.There was significant difference between the 4two groups. Conclusion Metformin can protect against the heart injury in diabetic.The mechanisms may be asso

11、ciated with inhibition of lipid peroxidation which can decreased the secretion of NF-B and COX-2 evoked by oxidative stress.Key words： metformin；diabetes mellitus；myocardium；anti-oxidative stress在糖尿病(DM)的诸多慢性并发症中，糖尿病性心肌病的危害最大，但由于其病因复杂，临床诊断及治疗困难，目前尚无治疗该病的特效药物。二甲双胍(Metformin，MT)是较传统的降糖药，近年由于其在心血管方面的突出

12、作用，对此药的研究日趋深入，特别是对其潜在非降糖机制的研究颇多1-2 。本研究以高脂高糖喂养加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的 2 型糖尿病动物模型为研究对象，观察 MT 对心肌在抗氧化方面的作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 5清洁级近交系 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠 45 只(由宁夏医学院实验动物中心提供)，8 周龄，体重为(22020)g ，实验动物许可证号：SCXK( 宁)2005-0001 。1.1.2 主要试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ) 购自 Sigma 公司；二甲双胍为天津中新药业股份公司生产；兔抗鼠 NF-B p65 及 COX-2

13、 多克隆抗体购自武汉博士德公司；MDA、SOD、FFA 试剂盒为南京建成生物工程研究所的产品；血浆胰岛素 ElASA 试剂盒购自大连泛邦试剂公司；微量血糖仪由罗氏公司提供；透射电镜型号为 HITACHI H-600。1.2 方法1.2.1 动物模型建立及分组 对照组 10 只大鼠饲以常规饲料，实验组 35 只饲以高脂高糖饲料(10%猪油、 20%蔗糖、2%蛋黄粉、1%胆盐、67%常规饲料)。喂养 6 周后，实验组大鼠隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素35mg/kg(以 pH4.5、0.1mmol/L 枸橼酸缓冲液配制成 20g/L 溶液)；对照组仅注射等容积的枸橼酸缓冲液，注射 1 周后，监测大鼠尾尖

14、血糖，以血糖11.1mmol/L 作为糖尿病成模标准，按以上标准剔6除未成模鼠 4 只，成模率为 88.6%，将成模糖尿病大鼠随机分为三组：单纯糖尿病组 10 只、小剂量 MT 干预组 11 只(SM 组)及大剂量 MT 干预组 10 只(LM 组) 。SM 及 LM 组分别予二甲双胍100mg/(kgd)及 300mg/(kgd)溶于 1mL 生理盐水灌胃治疗，对照组及单纯糖尿病组予以等容积生理盐水灌胃，每日 1 次；所有大鼠分笼喂养，充分供给食水，每周测 1 次尿糖和体重，每月测 1 次血糖，成模后共观察 12 周。1.2.2 观察指标 于灌胃后 12 周时进行标本收集，先测尾尖空腹微量血

15、糖，然后用 20%乌拉坦溶液按 5mL/kg 腹腔注射麻醉，剖开胸腹，心内采血，迅速取出心脏，冰盐水冲洗，滤纸吸干，称量心脏重量，计算心脏质量指数(心重 mg/体重 g)。(1)分离血清按试剂盒说明分别检测 INS、 TG、T-CH 及 FFA；(2)制备心肌匀浆检测：心肌组织SOD、 MDA(按说明书严格操作)，计算抗氧化比值AOR=SOD/MDA；(3)心肌电镜观察：于左心室前壁取 1mm3 心肌组织经戊二醛及锇酸双固定，梯度乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片观察超微结构变化；(4)NF-B p65 及 COX-2 的免疫组化染色(SABC 法)：严格按说明书操作，NF-B p65 为胞

16、浆或胞核呈棕黄色或棕褐色片状或颗粒状染色为阳性结果，COX-2 为细胞胞浆或间质着色为阳性，在 image pro-plus 6.0 病理图像分析系统下，7测定阳性区域的面积及平均光密度，计算累积光密度(IOD)=阳性面积 平均光密度。1.3 统计学方法 计量数据以均数标准差(xs)表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据用 SPSS 11.5 统计软件处理。2 结果2.1 各组大鼠一般情况比较对照组组大鼠精神状态良好，毛色白有光泽，无死亡；单纯糖尿病组大鼠均出现多饮、多食和消瘦等症状，且精神萎靡，毛色干枯；实验结束时，单纯糖尿病组死亡 2 只，血糖恢复正常 1 只；SM 组死亡 2 只，LM 组死亡 1 只。2.2 各组大鼠检测指标的比较( 表 1)表 1 各组大鼠检测指标的比较(略)与对照组比较，单纯糖尿病组及 SM、LM 组体重均明显减轻，差异有统计学意义(P0.01) ；单纯糖尿病组心脏质量指数明显增加，8应用 MT 治疗后显著减少(P 0.