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1、一、碱裂解法提质粒：2、每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液 II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液 I 的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌
2、不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。那么 EDTA 呢？大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了
3、溶液 I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液 II 了。这是用新鲜的 0.4M 的 NaOH 和 2的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4M 的 NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS(?)，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 mic
4、elle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4M NaOH，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。SDS：导致蛋白质变性。分子中疏水长链与蛋白质分子内部的非极性基团相互作用，而带负电荷的硫酸根可以与水作用，使蛋白质分子构象发生很大的变化。特别是寡聚蛋白的亚基解离并分别于 SDS 定量结合，成为易溶于水的复合物。SDS 是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋
5、白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与 DNA 的结合，使 DNA 释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。每个人都知
6、道，溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加入 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS 的加入有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1的 SDS溶液中慢慢加入 5 M 的 NaCl，你会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 N
7、aCl 而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的纳离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组
8、 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给合共沉淀了，尽管 SDS并不与 DNA 分子结合。那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性和复性的 DNA 分子在中性溶液中都是溶解
9、的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里用25/24/1 的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高
10、浓度的盐溶液（比如 4M 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，
11、在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用 tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA 会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带
12、。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有 710 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。2、 无水乙醇洗的时候真的是见到明显的沉淀，但是一用
13、 70%的乙醇一洗，就什么也没了无水乙醇（一般是要用 2 倍体积的）是沉淀核酸的（用异丙醇更好，只需要等体积就可以） ，既然你这时能看到明显的沉淀，说明确实提到质粒了。最后一步用 70%乙醇洗涤了以后再离心，洗涤只需要把管子润洗一下就可以 ,不需要把沉淀吹起来（原本致密的核酸沉淀可能被吹散）,一般再离心其实没必要 ,倒掉 70%乙醇时要盯住白色的核酸沉淀（其中有不少是 RNA）别一起倒掉就行了， 70%乙醇短时间内不会溶解核酸，时间长了可能会部分溶解核酸。洗涤的这一步不能太久。洗涤之后尽量控干乙醇后，可以在 37 度温箱烘干（用抽真空干燥最好） ，不能烘的太干，因该是在白色沉淀边缘变透明，中间
14、仍可见白色时最好。 （白色沉淀最好是贴在管底部，以防烘的过干难以看清时，你下面融解时 TE/R 溶液浸没不了）这样当你用 TE/R 消化融解质粒时，质粒就不会因为太干燥而难于溶解了。TE/R 是指加有少量 RNA 酶的 TE 缓冲液，配方分子克隆上都有。一般质粒需要在加过 TE/R 溶解后放于 37 度温箱 30 分钟，并每 5 分钟拨匀几下，沉淀中混有的 RNA 被降解掉，否则你跑电泳的时候会在溴酚兰前面看到大量的 RNA 被 EB 染的亮黄，会干扰泳道后面质粒的亮度，降解 RNA 也有利于后面对质粒进行酶切，和其它的操作。DNA 不溶于无水乙醇，可以用 2 倍体积的无水乙醇沉淀（注意摇匀，否则无质粒提出） 。也可用异丙醇沉淀（摇匀，否则无质粒提出。 ）
