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1、1胃癌患者外周血 hTERT mRNA 转录水平及临床意义作者：胡福军 凌志强 陈晓钟 余传定 【摘要 】 目的 研究胃癌患者外周血中 hTERT mRNA 的表达，探讨其作为胃癌肿瘤细胞标志物的可行性。方法 应用实时荧光定量RT-PCR 技术检测 96 例原发性胃癌、50 例胃溃疡和 60 例健康献血员血清中 hTERT mRNA 表达水平，并对阳性 PCR 产物进行克隆、测序。结果 胃癌组 hTERT mRNA 表达水平（12.780.97 ） copies/ml，显著高于良性胃溃疡组（0.930.23） copies/ml 和健康对照组（0.290.17) copies/ml。多变量分析
2、表明，hTERT 表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤生长方式、肿瘤分化程度、淋巴管侵犯、静脉侵犯均无显著相关性（p0.05） ，而与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、pTNM 分期及 CEA 有显著相关性（p0.05） 。结论 qRT-PCR 具有快速、敏感和特异的特点。定量分析外周血 hTERT mRNA 转录水平可作为胃癌的肿瘤细胞标志物之一，用于早期诊断。 【关键词】 胃癌 肿瘤标志物 hTERT mRNA 实时荧光定量 RT-PCR【Abstract】 Objective To investigate the expression and 2clinical value of hu
3、man telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA in the peripheral blood of patients with gastric carcinoma. Methods Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was applied to detect the expression of hTERT mRNA in 96 gastric cancer, 50 gastric ulcers, and 60 healthy individuals without known major dis
4、ease. PCR product was cloned into PUC19 vector and sequenced. Results hTERT mRNA expression was higher in gastric cancer patients (12.780.97) than gastric ulcer (0.930.23)(p0.001), and healthy individuals (0.290.17) (p0.05), but had a significant between hTERT mRNA expression level and the depth of
5、tumor infiltration, lymph node metastasis, distant metastasis, TNM staging and CEA values in gastric cancer (p0.05). Conclusion Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) is a rapid, sensitive and specific method to detect hTERT mRNA. And the hTERT mRNA in the peripheral blood may be a tumor marker of
6、gastric cancer, which can be used for its 3early diagnosis.【Key words】 Gastric cancer Tumor marker Hhuman telomerasereverse transcriptase mRNA hTERT mRNA Real-time fluorescence quantitative RT-PCR (qRT-PCR)胃癌在我国死亡率居恶性肿瘤之首位，但早期诊治的 5 年、10 年生存率分别可达到 95和 90 。因此，寻找敏感而特异的肿瘤细胞标志物对胃癌的早期诊治具有重要意义。端粒是真核细胞染色体末端
7、的特殊结构，可稳定维持染色体的功能，防止染色体 DNA 降解、末端融合，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长。端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关 。端粒酶（TERT）是使端粒延伸的反转录 DNA 合成酶，与细胞分裂及寿命控制有密切关系。端粒、TERT 对临床肿瘤的诊断和预后判断有一定意义2 。本研究，应用实时荧光定量 RT-PCR（Real-time fluorescence quantitative RT-PCR, qRT-PCR）技术检测胃癌患者外周血 hTERT mRNA 水平表达，探讨其作为胃癌肿瘤细胞标志物的可行性。1 材料与方法1.1 对象 42000 年
8、8 月至 2006 年 12 月手术切除的胃癌组织标本 96例，患者男 58 例，女 38 例，年龄 3178 岁(中位年龄 58.2 岁) ，术前均未接受放、化疗；胃溃疡手术标本 50 例，患者男 31 例，女19 例，年龄 3771 岁( 中位年龄 54.6 岁)；另取健康献血员 60 例，男 30 例，女 30 例，年龄 2049 岁( 中位年龄 38.5 岁) 。所有检测对象(胃癌、胃溃疡患者治疗前) 均于清晨空腹静脉采血 10 ml，室温静置后分三步骤离心(1000g 、10 mins1500g、10mins3000g、10mins)，获取无细胞血清并可避免淋巴细胞的直接干扰。血清液
9、氮速冻后保存于-80冰箱中直到试验结束。1.2 引物的设计与合成 根据 GenBank 提供的 hTERT mRNA 序列，利用 Primer Premier 5.0 设计引物，跨内含子序列。HTERT 引物：(F) 5-cggaagagtgtctggagcaa-3，(R)5-ggatgaagcggagtctgga-3 。GAPDH 引物：(F)5-cggagtcaacggatttggtcgtat，(R)5-agccttctccatg gtggtgaagac-3。1.3 RNA 提取与逆转录反应5Trizol（上海生工） “一步法”提取细胞总 RNA,溶解于 15 l DEPCH2O 中。提取
10、的 RNA 经 1琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA 的质量。吸取 1g 细胞总 RNA，加入随机引物 0.5 g。6510min后移至冰浴，随后加入 4l 5逆转录缓冲液，20U RNasin(40U/l)，1l 10mM 4dNTP, 用 DEPCH2O 补足至 19l, 混合均匀后,于70反应 5min,加入 1l MML反转录酶 (40U/l)，37反应1后，95热灭活 5 min，置 -20贮存备用。1.4 qRT-PCR 定量分析 用 LC real time PCR 仪（Roche Diagnostics）及 TaqMan SYBR Green （Roche Laboratories）
11、荧光法定量分析 hTERT mRNA 含量，用拷贝/ml 表示，并用 GAPDH 正常化校正。每次试验对空白管、阴性对照和 hTERT RNA 各设 4 个标准管，浓度分别为 104copies/L、103copies/L、102copies/L、101 copies/L，根据 hTERT RNA 标准品建立的标准曲线，由软件自动计算出待测样本中 hTERT RNA 的准确含量。每次试验中，阴性对照的 Ct 值（循环阈值）不显示任何数值，阳性参考品的标准曲线的 r 值介于-0.98-1。qRT-PCR 程序：9510mins 后，95105510s725s 扩增 45 个循环，6515s、sl
12、ope=0.1/s 进行溶解曲线分析，最后 4030s 结束反应。以溶解曲线、及阴、阳对照对比判断样品中 hTERT mRNA 扩增产物的特异性。同时 PCR 产物用6含溴化乙锭的 2%琼脂糖进行电泳， hTERT mRNA 阳性者可见131bp，内对照 GAPDH 为 308bp。1.5 PCR 产物纯化和克隆、测序按照试剂盒( 德国 Qiagen 公司产品)说明，割胶纯化 PCR 产物，克隆至 PUC19（大连宝生物公司）载体，转入 DH5感受态细菌中，37摇菌后提取质粒并测序。用紫外分光光度法计算拷贝数，梯度稀释作为标本检测时的阳性标准品。1.6 统计学方法 组间比较采用 2 检验。以
13、P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 qRT-PCR 分析96 例胃癌患者血清样品中均检测到 hTERT mRNA 上调表达（96/96，100%） ；50 例胃溃疡患者中 19 例（38.0%）检测到hTERT mRNA 表达，在健康对照组中均无表达。胃癌组、胃溃疡组与对照组相比，差异分别有统计学意义（p0.01） ；胃癌组与胃溃疡组之间同样差异有统计学意义（p0.01） 。72.2 hTERT 水平表达胃溃疡患者 hTERT 低水平表达(0.053.64 copies/ml)，平均(0.930.23)copies/ml；胃癌组 hTERT 水平表达相差较大(1.88128.37
14、copies/ml） ，平均(12.780.97)copies/ml。胃癌组与胃溃疡组比较差异有统计学意义（p0.01） 。2.3 质粒测序质粒测序由上海申友生物技术公司完成，测序结果与Genbank 提供的序列一致。2.4 多变量分析hTERT mRND 转录水平与胃癌临床生物学特征关系 见表1。表 1 hTERT mRNA 转录水平与肿瘤临床生物学特征的关系临床参数（略）注：为10 组、10100 组分别与100 组比较3 讨论 端粒是染色体末端 DNA 多个重复序列与特异性结合蛋白的8复合体，端粒长度反映细胞分裂增生能力，其长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关：端粒酶通
15、过延长端粒而促进细胞无限增殖，在多种恶性肿瘤中高表达，如肺癌、大肠癌、前列腺癌等3，4 。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是一种核糖核蛋白酶，由端粒 RNA 和端粒酶蛋白组成的一种特殊逆转录酶，在激活端粒酶的过程中起限速作用，能以自身 RNA 为模板合成端粒序列以稳定端粒长度使细胞获得永生， 也是人类端粒酶的活性中心，其表达是端粒酶活化的必须前题 。本资料 96 例胃癌患者 hTERT 均有表达，而 50 例胃溃疡患者中仅 19 例（38.0%）有表达，60 例健康对照组中无一例有表达，说明 hTERT 基因表达异常可能激活端粒酶，使正常胃上皮细胞的端粒长度不再缩短，从而参与胃癌发生。其异常表达可能在胃癌形成中具有重要的作用5 。本资料血清 hTERT mRNA 与临床病理参数相关性分析表明，hTERT 水平表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、
