《聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递【摘要 】 【目的】 研究非病毒基因载体聚乙二醇 (PEG)-聚乙烯亚胺(PEI)共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。 【方法】 将含PEG 不同分子量和接枝量的 PEG-PEI 共聚物，与 DNA 形成复合物。考察带正电荷的 PEI 与带负电荷的 DNA 的相互作用，测定了 PEG-PEI/DNA 复合物的粒径和 Zeta 电位，及对 Hela 细胞的毒性和转染率。 【结果】 PEG 侧链并未明显影响 PEI 与 DNA 形成复合物的能力；连接 PEG 5 000 能够明显降低复合物的粒径；复合物的Zeta 电位随着 PEG 接枝量的增加而降低；
2、细胞毒性不依赖于 PEG的分子量的变化，而是取决于 PEG 的接枝量；共聚物 PEG-PEI(2-25-1)被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。 【结论】 共聚物的结构组成对 DNA 复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。 【关键词】 PEG-PEI 共聚物； 非病毒基因载体； 基因转染基因治疗是将外源性基因导入靶细胞内有效表达，从而使得在基因水平治疗一些顽疾成为可能。将外源性基因导入体内必须借助于一个安全、稳定、转染率高的载体。目前，基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。体内基因治疗 80%采用病毒载体系统作为2基因传输载体, 例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等,非病毒载体
3、包括脂质体和阳离子聚合物。病毒载体与非病毒载体相比转染率高，但存在着一些安全隐患，如对特异的细胞有限制性靶向性，DNA 装载量有限，潜在的病毒重组和成本较高等问题使得它的实际应用受到限制1。非病毒载体如阳离子脂质体和阳离子共聚物可克服目前病毒载体在安全性、免疫原性和价格方面等问题2。在目前应用的非病毒载体中，多聚阳离子共聚物聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI） ，在体内外都表现出高的转染率3 。 PEI 的重复结构单体中每两个碳原子就连接含氮原子的伯胺和仲胺，支链型的 PEI 还包括叔胺，都可质子化生成正电性氨基，成为与DNA 上带负电荷的磷酸根结合的作用点，形成纳米级的聚
4、合物/DNA 复合物，可被细胞摄取。另一方面，大量的阳离子电荷产生较大的毒性，限制了阳离子共聚物的体内应用。因此，许多学者研究将阳离子共聚物连接上非离子的亲水性基团，如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）4， 聚N- （2-羟丙基）异丁烯酰胺 5。这些亲水性的共聚物可提高复合物的溶解性，减少聚集，减少生理环境下与蛋白的非特异性相互作用 6。本文采用异佛尔酮二异氰酸酯（isoporon diisocyanate, IPDI）作为偶联剂制备了含不同 PEG 分子量和接枝量的 PEG-PEI 共聚物。考察了聚合物/DNA 复合物的粒径和 zeta 电位，还考察了转染率与 PE
5、G-PEI 共聚物的毒性和结构的关系。研究 PEG 链长与接枝量对基因传递过程的影响和规律。31 材料和方法1.1 试剂聚乙烯亚胺（PEI，MW25000， Aldrich-Sigma 公司产品，支链型，无水） ；聚乙二醇单甲醚(mPEG, MW 为 2000 和 5000 ，Fluka 公司) ； IPDI(广州市汇采涂料化学品有限公司，进口分装） ；二月桂酸二丁基锡（dibutyltin dilaurate, DBTL，广东丽宝涂料助剂公司） 。1.2 细胞系人宫颈癌细胞系 Hela 细胞（ATCC No.CCL-2.1） ，在 100 mL/L 小牛血清的 RPMI1640 培养基中培养
6、。血清 56 灭活 30 min。1.3 质粒真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, pEGFP-C1)，由华西医科大学惠赠，由 CMV启动子驱动，在 DH5 菌株中大量扩增。由 QIAGEN 公司的质粒4大抽提试剂及纯化柱制备质粒，酶切鉴定。1.4 异氰酸酯单端基聚乙二醇（PEG-NCO）的制备定量的 mPEG 溶于无水氯仿中，加入过量的 IPDI，溶于氯仿，再加入 0.6%0.7% 的催化剂 DBTL。将上述两溶液混合， 75 左右回流反应 8 h，所得产物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重复多次直至
7、将过量的 IPDI 去除干净，真空干燥，得白色蜡状至粉末状固体。1.5 PEG-PEI 嵌段共聚物的合成将 PEI 用一定量的氯仿溶解，磁力搅拌下将 PEG-NCO 的氯仿溶液逐滴加入 PEI 溶液中，再加入 0.6%0.7% 的催化剂 DBTL，置60 回流反应 16 h，将亮黄色溶液浓缩至约 50 mL 左右，再用大量乙醚沉淀，过滤，真空干燥，称质量。1.6 PEG-PEI/DNA 复合物的制备根据不同的 N/P 比，即聚合物中的氨基基团与 DNA 中的磷酸基团的摩尔比，用 PBS 制备一定的聚合物溶液，与质粒 DNA 的PBS 溶液混合，涡旋，室温静置 30 min,以获得聚合物/DNA
8、 复合5物。1.7 细胞毒性测定（MTT 法）PEI、PEG-PEI 共聚物在 100 mL/L 胎牛血清的 1640 培养基中配成不同浓度梯度，分别为 1、3 、5、10、15、20 g/mL。将Hela 细胞接种到 96 孔板上，密度为 5 000 个细胞/孔，细胞培养24 h。吸去每孔中的旧培养液，加入不同浓度的含 PEI 及 PEG-PEI共聚物的培养液，每孔 0.2 mL，每个浓度 4 个复孔，37 ，5% CO2 培养箱中培养 24 h 后更换正常的 RPMI 1640 培养液继续培养 48 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 L，继续培养 4 h，吸尽培养液，每孔加入
9、 DMSO 溶液 150 L ，在 Bio-Tek Elx800 型酶标仪 490/630 nm 波长处读取吸光度值（ A） ，计算细胞活力（%）=实验组 A490/630/阴性对照组 A490/630100%。1.8 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验为了证明正电荷的 PEI 与负电荷的质粒 DNA 之间的相互作用，采用琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。将 DNA 与不同浓度的 PEI、PEG-PEI 共聚物按 N/P 比分别为 0.5、1、1.5 、2 、2.5 、3 、4、5，在PBS 中形成复合物，室温静置 30 min。电泳条件： 10 g/L 琼脂糖（含 0.5 g/L 溴化乙锭） ，1 TBE 缓冲液
10、，电压 80 V，电泳时间640 min。DNA 条带在紫外灯下进行观察。1.9 粒径和 Zeta 电位测定将 DNA 与不同浓度的 PEI 和 PEG-PEI 共聚物分别按一定的N/P 比在 PBS 中形成复合物，使 DNA 的终浓度为 20 g/mL，室温静置 30 min，在 Zetasizer Nano Series 90 粒径分析仪上，测定粒径及 Zeta 电位。1.10 细胞转染试验将 Hela 细胞接种到 12 孔板上，密度为 15 000 个细胞/孔，培养 24 h，细胞汇合度70%，将 PEI、PEG-PEI 共聚物与 DNA 分别在 PBS 中配成一定浓度的溶液，然后将两者
11、以一定的 N/P 比混合，涡旋，室温静置 30 min。转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的 RPMI1640 培养液 1 mL，再每孔加入 100200 的 PEG-PEI/DNA 复合物，细胞培养箱中培养 4 h 后，吸去转染复合物，加入新鲜的含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液继续培养4048 h，转染后用 PBS 冲洗，再用 0.25 g/L 胰酶/EDTA 消化液将细胞消化下来，用 PBS 重悬细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每 10 000 个细胞中发荧光的细胞百分数获得。2 结 果72.1 共聚物的合成共聚物的合成方法参照文献7，PEG-PEI 共聚物中
12、两组分的比例见表 1。2.2 细胞毒性试验RGR (relative growth rate)为相对增值百分率，通过细胞的存活率来推定聚合物载体内在的细胞毒性。其值越大则毒性越小。从图 1 显示结果可以看出，均聚物 PEI 的细胞毒性随着浓度的增高显著增加，而共聚物在低浓度 10 g/mL 以下时未表现出明显毒性，15 g/mL 以上时 PEG-PEI 的毒性比 PEI 明显减少，且随着共聚物中聚乙二醇含量的增加而降低。接枝 PEG 的分子量不同，对共聚物的毒性未见明显影响。2.3 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验图 2 表明，PEI 均聚物在 N/P =2 时可完全和 DNA 结合，阻止溴乙锭插入 D
13、NA 双螺旋结构中，故观察不到荧光，当每个 PEI 上连接 10.5 个 PEG 2 000 即 PEG-PEI(2-25-3)和每个 PEI 上连接 7.2个 PEG5 000 即 PEG-PEI(5-25-3)时，DNA 在 N/P 为 2.5 的时候8可被完全阻滞，说明接枝 PEG 后，对 PEI 结合 DNA 的能力没有显著影响。2.4 粒径和 Zeta 电位许多学者研究发现,DNA/载体复合物粒径是影响转染效率的主要因素之一8，随着 N/P 比增加，复合物的粒径均逐渐减少，同时PEG 5 000 能显著影响 PEG-PEI/DNA 复合物的粒径，且随着 PEG 5 000 比例的增加
14、，粒径呈减少趋势。接枝不同分子量的 PEG 对粒径也有不同影响。当接枝分子量较小的 PEG 2 000 时，粒径相对较大（图 3） 。PEG-PEI 的 Zeta 电位比 PEI 均聚物低，而且随着 PEG 含量的增加而降低。在 N/P=10 时，PEI 的 Zeta 电位约为 40 mV；当接枝的分子量为 2 000 的 PEG 时，随着 PEG 含量的增加，Zeta 电位逐渐降低，最小到达 28 mV；当接枝分子量为 5 000 的 PEG 时，随着 PEG 含量的增加，Zeta 电位下降更快，最终降低到 20 mV（图4） 。2.5 转染试验复合物的转染试验用与毒性试验相同的 HeLa
15、细胞研究。GFP 转9染进入细胞 4048 h 观察荧光表达（图 5） 。从转染试验结果可以看出，PEI 接枝少量的 PEG 2 000 或 PEG 5 000 可使转染率提高，PEG-PEI(5-25-1)在 N/P 为 20、30 、50 时的转染率均较 PEI 有所提高，而 PEG-PEI(2-25-1)的转染率提高显著，且在 N/P 比为 30的时候达到最大值。随着 PEG 含量继续增加，PEG-PEI 的转染率与PEI 相比有降低的趋势。由于 PEI 的毒性较大，当 N/P 比增加至 50时，细胞死亡较多，转染率都较共聚物低（图 6） 。3 讨 论共聚物的合成是将线性的 PEG 接枝
16、到支链的 PEI 大分子上，本反应需要一个既与 PEG 上的羟基反应，又与 PEI 上的氨基反应的偶联剂，异佛尔酮二异氰酸酯（IPDI ）符合此要求。 IPDI 属脂环族二异氰酸酯，IPDI 的 2 个异氰酸基连接方式不同，活性也不同，脂链上 NCO 的活性比脂环上的 NCO 的活性大 810 倍。在预聚反应中 mPEG 被活化，脂链上的 NCO 在催化剂作用下先与 PEG 上的-OH 反应，脂环上的 NCO 再与 PEI 上的氨基反应，故反应简单，副反应少。文献报道，分子量较大的 PEI 毒性也较大9,经无毒、抗免疫原性的水溶性大分子 PEG 修饰 PEI 后，与 DNA 自组装成核壳结构胶束，其芯核由 PEI 与 DNA 通过静电作用缔合而成，PEG 构成保护10性的水溶性外壳，从而使 PEI 的毒性降低。接枝 PEG 的量越多， PEI 的毒性降低的越多。接枝分子量小的 PEG 毒性降低是由于相对
