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1、利用基因工程生产植物次生代谢产物摘要：植物次生代谢产物对于控制和影响植物性状起着十分重要的作用，也为人类提供了所需的药物、染料、香料等众多的化合物。综述了植物众生代谢途径的研究、相关基因的克隆以及次生代谢的基因工程。 绿色植物是将光能转变成化学能的生物应应器，是人类赖以生存的最重要的基础。它不仅为人类提供生命所必需的碳水化合物、脂类、蛋白质等初生代谢物，同时也为人类提供许多有益的次生代谢物。植物次生代谢物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。植物次生代谢物种类繁多，现在已知大约有 10000 种，包括酚类、黄酮类、香豆素
2、、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，一般可分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物 3 大类。植物次生代谢物是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，对植物在生态系统中的生存起作用，如抗虫、抗病、异株相克、吸引昆虫授粉、与共生微生物相互作用等。 人类利用植物次生代谢物的历史十分悠久，各民族传统草药和香料的有效成分大多是该类物质。中国的本草学则是世界上利用植物天然产物的杰出代表、现在仍从植物中提取的重要药物有 50 多种。直到今天，这些天然产物仍在人类生活中扮演着重要角色，尤其为医药、轻工、化工、食品及农药等工业的发展所必不可少。随着回归自然的呼声日益高涨，人们已认识到现在是
3、从高等植物的次生代谢产物中寻找新药的时代。然而，长期缺少有计划的采集致使生态环境受到破坏，许多野生植物濒危，一些特殊生境下的植物人工引种尤为困难。能够引种栽培的植物也要占用大量农田，加之受环境的制约，使次生物的含量和质量不稳定。此外，在通常情况下，天然植株中目的次生产物含量过低（如紫杉醇）；采用化学合成的方法，又会遇到工艺流程复杂、成本高、产生同分导村体及环境污染等许多问题。近年来，随着对植物代谢生理、生化及生态适应方面认识的深入，以及分子生物学的渗透，植物次生代谢分子生物学研究发展迅速，利用基因工程大规模生产次生代谢产物具有诱人的前景。 1 植物基因工程的目标 将外源新基因转入植物的技术现在
4、已很普遍，基因枪和根瘤农杆菌介导是最常用的方法。利用基因工程改良植物性状的可能性多种多样：使内源性抗性化合物（如植物抗毒素）在高水平上表达，表现出更高的抗虫及抗病能力，提高产量和质量；在花卉栽培中培育出特定的花色、花香；改善水果的口味；降低食品和饲料中有毒成分的含量（如饲料中的双吡咯烷类生物碱或芥子油苷，咖啡豆中的咖啡因）；提高有益成分的含量（如番茄中的黄酮，水稻中的维生素 A）。 但是次生代谢物或新的化合物在植物中的高水平表达可能导致潜在的毒性，因此对转基因食品（饲料）进行风险评估是必要的，也是必需的。 2 次生代谢途径 为了实现上述目标，必须清楚植物的次生代谢途径。现在了解得比较清楚的是黄
5、酮类和萜类的生物合成途径，常用的方法是把用放射性标记的中间体结合在终产物中，作为经由前体代谢的证据。这种方法最主要的问题是中间体的合成十分困难，另外中间体衰变后放射性标记可能通过另外的途径代谢。因此必须挑选稳定的同位素，例如常用的 13C 在产物中的结合位点可以通过 13CNMR 来确定。 当酶的活力低下甚至无法从植物中提取到有活性的酶时，需要对多种不同的植物作平行研究。Van Tegelen 从欧茜草和长春花中提取异长春胺合成酶，花了 2 年时间都没有从欧茜草中得到所需量的酶，而仅仅用了几个星期就从长春花中获得了足量的纯蛋白用于氨基酸测序。Yamamoto 从日本山茶中成功地分离出次番木鳖苷
6、合酶，而从长春花中却没得到。 蛋白质组学为鉴别次生代谢酶提供了新途径，利用二维凝胶电泳进行原位肽的消化，遇过质谱检测可以获得内源氨基酸的顺序。首先，寻找关键酶需要植物体、植物组织或值物细胞在一定条件下生成所需的产物，由这些产物经过凝胶电泳得到蛋白图谱，这时与产物相联的蛋白质就能被鉴别出来。再经过质谱测定的氨基酸序列用于基因克隆研究。最后是证明该基因在代谢途径中的功能，这一步绝非易事。生物信息学可以确定哪种酶是关键酶，但最有力的证据必须是在合适的系统中进行基因表达和合成有功能的蛋白。把植物细胞转入根瘤农杆菌共培养也可能是一种合适的方法，尤其适用于依靠翻译后修饰的酶、共生因子、酶作用底物或者出现其
7、他的酶。一旦没有中间体，就无法测定蛋白质功能。用反义基因推测基因功能和分析次生代谢图谱是用来测定基因表达产物（如蛋白功能）的新方法。代谢途径中的某一步化学反应可能是没有酶参与的自发反应，例如在吗啡的生物合成过程中异喹啉生物碱转变为可持因酮的反应。另外，一种酶也可以催化两种反应，如莨菪素由 6-羟基莨菪碱变为东莨菪碱的反应中起催化作用的 6-莨菪碱羟化酶。 在罂粟的生物碱含成过程中酶表现出很强的专一性。细胞色素氧化酶 P450 只能选择性催化 R-异构的网状番荔枝碱底物形成吗啡烷骨架；而小檗碱桥接酶则选择性催化 S- 异构的底物。在莨菪中合成莨菪烷生物碱的过程中，两种还原酶催化莨菪烷分别进入两条
8、不同的代谢途径，各产生一种莨菪酮的立体异构体，而只有在菪碱是莨菪烷生物碱和东莨菪碱的前体。 总体上讲，大多数植物次生代谢物产生于乙酸、莽草酸及甲羟戊酸等少数几个前体。这些前体来自初生代谢，一般处于代谢的分支点，经酶催化形成几大类基本骨架。每一类结构大致相同，再经过各种类型的酶促反应进行修饰，产生千差万别的次生代谢产物。参与的酶可能有共同的来源，在某一步转变中进行了特异的加尾修饰。在代谢途径中，区室化起着重要的调控作用，如莨菪烷生物碱在植物报中产生，但储存在绿色组织器官中；莨菪碱在莨菪根的中轴鞘细胞发生环氧化作用形成东莨菪碱。 3 植物次生代谢酶的分子克隆 利用对酶的鉴别和纯化，获得了大多数编码
9、酶的基因的克隆，据 Somerville 估计，目前约有1000 种植物基因的功能是已知的。大多数植物早期合成途径是相近的，可以利用基因的同源性从其他植物中克隆同源基因，但是编码具体酶的基因在基本骨架外更有其特殊的修饰，因此模式植物基因组序列价值有限。而如何获得所需的酶依然是制约的瓶颈。克隆突变基因也有很多问题，例如怎样获得大量的植物突变，怎样对感兴趣的突变进行分析等。 转座子和转移 DNA（tDNA）标记技术为克隆突变基因提供了便利的方法。在长春花中选择对毒性氨基 4-甲基色氨酸酶（4 mt）耐受的细胞，可能是色氨酸脱羧酶（TDC）超量，从而使 4mt 变为对细胞无毒的 4-甲基色胺。Van
10、der 结合 tDNA 活力标记，在长春花基因组中随机整合带有强启动了的 tDNA，激活 TDC 基因，也激活了控迹 TDC 表达的犒控基因。从而提高 TDC 活力。这样可以克隆 AP2-域转录因子，它是一个长春花次生代谢的基本调控基因。 酵母双杂交系统已被用来寻找相互作用的酶。在次生代谢中酶可能呈聚合态，如果有一个相关基因是已知的，就可以用酵母菌双杂交系统克隆编码聚合酶的基因。这种方法已成功地用于克隆拟南芥中编码黄酮合成的聚会酶基因。差示筛选法是另一种克隆基因的方法，已从长春花中克隆到编码细胞色素 P450 的牻牛儿醇-10-羟化酶（G10H）的基因，但所克隆基因没有获得编码酶的 G10H
11、活力。用 PCR 筛选同源性 P450 也无结果，最终是通过纯化 G10H 酶和对一些内源氨基酸测序，并以此为探针才得以克隆到所需基因。Lange 报导用表达序列标签（EST）鉴定薄荷腺香毛簇分泌油的基因，并从中分离出纯品。他们成功地分离出特异合成议类的 mRNA，通过对 cDNA 文库中 1300 条 ESTs测序，并与已知序列比较，得到功能基因，并在大肠杆菌中获得表达。随着植物基因序列数据库的快速扩增，EST 的使用将导致基因的鉴定是指数级增长。 4 植物次生代谢的基因工程 4.1 植物细胞培养 利用生物反应器大量培养植物细胞，生产植物次生代谢产物在技术上是可行的，但目前在商业上获得成功的
12、只有紫草宁（素）和人参。尽管有些植物细胞培养会对切应力敏感，大多数培养还是能在大的生物反应器中进行。问题是植物细胞生长慢、产量低，导致成本太高。对吗啡、可待因、天仙子胺、东莨菪碱、长春花碱和长春花新碱等的需求不能完全由细胞培养来满足。代谢工程的兴起，使得细胞培养的产率可以达到土壤栽培的水平，符合商品化植要求。植物细胞培养也是研究生物合成次生代谢产物的有用模式，适合喂饲实验和研究各类效应器的信号传导途径和调控机制。 42 生物转化 植物细胞工厂和一般意义上的工厂在组织和调控上有很多相似的地方，通过多因素协同作用、反馈抑制、转运、区室化、酸碱度等，共同影响着代谢产物的流动。针对提高次生代谢物产量这
13、个目的，可以采取不同的策略：使内源基因超表达或者导入外源异构酶，下游产物对其没有反馈抑制或者对底物有更高的亲缘关系，从而克服速率限制步骤；在代谢途径的分支点引入反义基因，阻滞前体向副产物代谢路线流动；降低分解代谢速率；调控基因超表达等。 在自然界中，很多有重要价值的次生代谢物往往含量较低，而前体却很丰富。将这些前体转变为目标产物具有实用价值，用生物方法效率高、专一性强、耗能低。将克隆的代谢关键酶基因导入微生物来生产大量的酶，再结合微生物发酵或固定化酶技术，可将前体转变为终产物。该技术的前提条件是在微生物中有必需的前体，而且中间产物和终产物对微生物细胞无毒。POtrykus 等将多个外源基因同时
14、转入水稻中，先合成 -胡萝卜素，再进一步转变成维生素 A。稻谷因富含维生素 A 而显金黄色，黄金稻可能解决非洲和不发达国家人民（尤其是儿童）因营养缺乏造成的失明症。 4.3 发根培养 植物基因工程技术与农杆菌的研究密切相关。发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes 是一种革兰氏阴性菌，通过把含 Ri 质粒（root- inducing plasmid）中的 tDNA 转移并整合到植物基因组中，进而诱导毛状根产生。在形态方面，Ri 质粒诱导快速生长的、非向地性、高度分支的发报的形成；在代谢方面，Ri 质粒转化很能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，且具有遗传稳定性。应用发根培养技术生产的次生代谢物有生物碱类（包括吲哚生物碱、喹啉生物碱、莨菪烷生物碱、喹嗪烷生物碱等）、苷类（如人参皂苷、甜菜苷）、黄酮类、醌类（如紫草宁）以及蛋白质（如天花粉蛋白）等。
