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1、1气管插管快速灌注博莱霉素复制大鼠肺间质纤维化模型作者：张伟, 鲁香凤, 张晓梅, 吴建军, 姜良铎【摘要 】 研究大鼠肺间质纤维化的造模方法。 方法：模型组大鼠气管插管灌注不同剂量（7、6 、5、3.4 、 2、1 mg/kg 体质量）的博莱霉素 A5-生理盐水，对照组给予等体积生理盐水，观察大鼠生存情况、肺组织病理，并深入研究博莱霉素 1 mg/kg 体质量组，观察大鼠体质量变化，肺组织病理，检测第 14 天、28 天、45 天时大鼠肺系数以及血清中转化生长因子 1（transforming growth factor 1, TGF-1）和血小板衍生生长因子（platelet-derive
2、d growth factor, PDGF）的含量。结果：经多个剂量的研究发现，较大剂量博莱霉素气管插管快速灌注法复制大鼠肺间质纤维化模型死亡率高，1 mg/kg 体质量气管内灌注博莱霉素 A5-生理盐水可以造成大鼠肺组织纤维化改变。深入研究发现，与假手术组比较，1 mg/kg 体质量组大鼠肺组织病理 14 d 已出现明显的纤维化改变，28 d 已形成弥漫性纤维化，45 d 时纤维化程度进一步加重。与假手术组比较，模型组 3、7 、14 d 体质量降低（ P0.01） ，21 d体质量虽有所下降，但差异无统计学意义（P0.05） ；14 、28、45 d 时肺系数升高（P0.01） ，血清 T
3、GF-1 水平从 28 d 时开始升高（P0.05，P0.01） ，血清 PDGF 水平 45 d 时升高2（P0.05） 。1 mg/kg 体质量组造模死亡率较低。结论：博莱霉素 1 mg/kg 体质量气管插管快速灌注法可以成功复制大鼠肺间质纤维化模型。 【关键词】 肺纤维化; 模型, 动物; 博莱霉素 ; 大鼠Method: Different doses (7, 6, 5, 3.4, 2, 1 mg/kg) of bleomycin A5-saline were infused into the rats lung in bleomycin-treated group through t
4、racheal intubation, and rats in sham-operated group were infused with same volume of saline. The living state and lung pathology of the rats were observed. The author deeply studied the condition of the rats in 1 mg/kg bleomycin-treated group, and the changes of body weight and lung pathology were o
5、bserved. Lung quotient, the content of transforming growth factor 1（TGF-1）and platelet-derived growth factor (PDGF) in serum were measured on the 14th, 28th and 45th day of the experiment.Results: The study demonstrated that infusing large doses of bleomycin A5 quickly through tracheal intubation ha
6、d a high mortality, and infusing 1 mg/kg quickly could 3successfully develop an animal model of pulmonary fibrosis. Compared with the sham-operated group, fibrosis was appeared obviously in the rats lung in 1 mg/kg bleomycin A5-treated group after 14 days of experiment, diffuse fibrosis was appeared
7、 after 28 days of experiment, and the fibrosis became more severe after 45 days of experiment. The body weight of the rats in bleomycin-treated group was declined after 3, 7 and 14 days of experiment as compared with the sham-operated group (P0.05). Lung quotient was increased 14, 28 and 45 days aft
8、er the experiment (P0.01), the level of serum TGF-1 began to increase since 28 days after the experiment (P0.05, P0.01), and the level of serum PDGF also increased gradually 45 days after the experiment (P0.05). And the mortality rate of 1 mg/kg bleomycin A5-treated group was lower than those of the
9、 other doses of bleomycin A5-treated groups.Conclusion: A rat model of pulmonary fibrosis can be 4duplicated successfully by infusing 1 mg/kg bleomycin A5 quickly through tracheal intubation.Keywords: pulmonary fibrosis; model, animal; bleomycin; rats肺间质纤维化是一种难治性肺系疾病，研究肺间质纤维化的经典模型为博莱霉素（bleomycin, BL
10、M）诱导的大鼠或小鼠肺间质纤维化模型，该模型的病理变化基本符合肺间质纤维化的病理改变，因此被广泛采用。造模方法多以气管插管或气管切开后灌注 BLM，使药物直接进入两肺为主。本课题组经过多个剂量（7、6、5、3.4、2、1 mg/kg）的实验，再结合大鼠肺组织病理变化和死亡率，发现通过 BLM 1 mg/kg 体质量气管插管快速灌注法可以成功复制大鼠肺间质纤维化模型，且死亡率低。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性 Wistar 大鼠，体质量180 200 g。由北京维通利华公司提供。许可证号：京动许字（1999）第 039 号。51.1.2 主要药品 BLM（15
11、 mg/支，日本化药株式会社，批号为740140） ；平阳星（ 8 mg/支，天津太和制药有限公司，批号为050402） 。1.1.3 主要器材 18 号套管针、光源、纱布、35 度倾斜鼠板、LEICA RM2135 石蜡切片机（德国） 、LEICA DMLB 显微镜（德国） 、OLYMPUS 全自动显微摄像系统（日本） 、K-70 全自动高速冷冻离心机（湘仪-TOMY） 、SPECOTRAT 酶标比色仪（ SLT 公司） 。1.2 实验方法1.2.1 溶液配制 BLM，用注射用生理盐水配成浓度为 4 mg/ml（0.4）的溶液。平阳星，用注射用生理盐水配成浓度为 5 mg/ml（0.5） 、
12、4 mg/ml（0.4） 、2 mg/ml（0.2 ）的溶液。1.2.2 造模方法 大鼠腹腔注射 10水合氯醛 3.5 ml/kg 体质量麻醉后仰面固定于 35 度倾斜鼠板上，将光源直接照射于大鼠咽喉部皮肤表面，左手垫纱布向外向上提起舌头，可见咽喉部有一明显的亮点。从大鼠口腔，右手水平插入 18 号套管针到达咽喉部时，压低针尾，使针头抬高 1530 度角，轻轻插入气管，长度约套管针长度的 3/4，拔出针芯。将棉球薄片置于套管针外口，若棉球薄6片随呼吸前后摆动，则说明套管针已经插入气管，若棉球薄片不随呼吸前后摆动，可能套管针误入食道，应立即拔出重新插入。向气管插管内快速注射 BLM 溶液，假手术
13、组注射等体积生理盐水，并继续向气管内快速推注 0.30.5 ml 空气，立即将大鼠直立旋转，以使药液在双肺内分布均匀。动物清醒后随意进食。1.2.3 造模情况 第 1 次：BLM 用注射用生理盐水配成浓度为 4 mg/ml（0.4）溶液，造模剂量为 1.5 ml/kg 体质量，即 6 mg/kg 体质量。共 130 只大鼠。第 2 次：平阳星用注射用生理盐水配成浓度为 5 mg/ml（0.5 ）溶液，原拟分为 7、6、5 mg/kg体质量等 3 个剂量组，即 1.4、1.2 、1.0 ml/kg 体质量，但由于实际操作中药物损失，最后 1 只药量不足，反推计算药量为 3.4 mg/kg 体质量
14、，形成 7、6、5 、3.4 mg/kg 体质量等 4 组，各组大鼠数量分别为 2、2、4、1 只。第 3 次：分为 2 个剂量组，2 mg/kg 体质量剂量组，平阳星浓度为 4 mg/ml（0.4 ） ，用量为0.5 ml/kg 体质量；1 mg/kg 体质量剂量组，平阳星浓度为 2 mg/ml（0.2） ，用量为 0.5 ml/kg 体质量。每组各 2 只。第 4 次：深入研究 1 mg/kg 体质量模型，平阳星浓度为 2 mg/ml（0.2） ，用量为 0.5 ml/kg 体质量，共 44 只。分为 24 h、72 h、7 d、14 d、28 d、45 d 共 6 个时间点，前 3 个时
15、间点各 5 只，后 3 个时间点共 29 只，由于有死亡大鼠，14、28、45 d 取材数量分别为8、8 、9 只。71.2.4 取材方法 10水合氯醛 3.5 ml/kg 体质量腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠仰卧固定于解剖台上，常规消毒切开皮肤，分离腹主动脉，用注射器采血，分离血清，置30 冰箱冻存，备用。打开胸腔取出肺脏，完整分离出气管和双肺，仔细去除周围结缔组织，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，电子天平称量肺湿质量，计算肺系数。右肺冻存制备组织匀浆液，左肺经大体观察后用 10%福尔马林液固定。1.2.5 血清转化生长因子 1 和血小板衍生生长因子检测 采用酶联免疫法测定血清中转化生长因子 1（transforming growth factor 1, TGF-1） 、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）的含量。试剂盒由尚柏生物医学技术（北京）有限公司提供。1.2.6 肺组织病理检查 左肺经 10%福尔马林固定后取材，常规石蜡包埋，连续切片 2 张，分别做 HE 染色和 Masson 染色（改良法） ，光镜下观察。1.3 统计学方法 采用 SPSS 11.0 软件包进行统计学处理，实验数据用
