流式实验如何设置对照

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1、流式实验如何设置对照 A、空白对照 细胞内物质自身也发出荧光,能被 FCM 灵敏的检测到,这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照(未染色的细胞),用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光,避免假阳性的结果。如上图。流式结果中荧光强弱是一个相对值,光电倍增管电压越大,电子信号越强;电压越小,信号越弱。通过调节电压,使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置,实验组的荧光值都是相对对照组。如下图:B、 同型对照 IsotypeControl非特异性染色 抗体的 Fc 段可以与细胞表面的 Fc 受体非特异性结合; 抗体进入胞内,不容易洗脱,造成非特异性染色。 同型对照是指使用与实验抗体相同

2、种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照,用于消除抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。比如实验抗体:FITC-CD3 单克隆抗体为鼠 IgG1 亚型抗体;同型对照:未免疫小鼠血清纯化的 IgG1,并标记 FITC,相同剂量C、 阳性对照 PositiveControl设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效,并不是每次分析时都必须设置: a) 使用新的荧光素抗体时;b) 使用存储时间较长的荧光素抗体时。c) 设置阳性对照的方法:d) 用肯定表达有该抗原的细胞来检测;e) 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。D、单标对照 Single Staining Control 用来调节补偿。

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