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1、项目十四 药品的微生物学检验,214页 附录5 思考以下问题：,要求无菌的生理盐水注射液如何检验是否无菌？有抗菌作用的青霉素粉针剂又如何检验是否无菌？口服药如何检验细菌数是否1000/g？,视频资源,供试品的制备http:/ 无菌检查和微生物限度检查http:/ （上）,药品标准和食品标准是两套不同的体系。药品微生物检验的验证更加严格：方法更加可靠，且不易被供试品中的抑菌物质干扰,药品检验结果的可靠性来自于严谨的方法学验证。为何规定要进行方法学的验证？,许多药品本身具有抑菌性(如抗生素类药品、含防腐剂药品)会对检查结果带来影响样品的预处理方式、检验条件和培养条件也都会影响到样品的微生物检测结果
2、检验方法的准确性、有效性和重现性,药品微生物检查,无菌检查：药品物品是否呈无菌状态微生物限度检查：物品中含有微生物的数量 控制菌检查：是否有指定的病原菌存在,药品的无菌、微生物限度检查的验证试验,方法：在采用的检验方法和过程中，通过分别加入规定量的代表性微生物以试验供试品是否在规定的检验量、在所采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消除了抑菌性(供试品本身的以及操作系统中可能对微生物生长有影响的各种因素)以试验所用方法对微生物生长无不良影响,无菌检查所用的培养基制备,需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐流体培养基真菌培养基：改良马丁培养基选择性培养基：对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)，聚
3、山梨酸培养基(用于油剂药品的无菌检查),培养基的保存,配制后灭菌，灭菌好的培养基应保存在225、避光的环境若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用,培养基的适用性检查,检查培养基是否无菌及灵敏度培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检,培养基的无菌性检查,每批培养基随机取不少于5支(瓶)，放置于相应的温度下培养14天培养基应无菌生长，表明所制备的培养基达到无菌要求,培养基的灵敏度检查,接种低浓度的试验菌株，培养观察生长情况培养基灵敏度判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则说明该培养基可以使低浓度的微生物也良好生长，表明培养基的灵敏度符合规定,
4、试验菌株,需氧菌有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26003、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501厌氧菌有生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64941酵母菌有白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98001霉菌有黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98003,对试验菌株的要求,菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第
5、0代)试验菌株用于试验时，细胞或孢子浓度需小于100cfu/ml,菌悬液制备 (如何使浓度100cfu/ml?),接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2328培养2448小时上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数小于100 cfu/ml的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可在24小时内使用,接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，加入3
6、5ml含0.05(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含孢子数小于100 cfu/ml的孢子悬液。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在贮存期内使用,菌悬液制备 (如何使浓度100cfu/ml?),培养基接种及培养,取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种上述浓度的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌等4种菌的菌悬液各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种上述浓度的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1
7、支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。,常用的稀释液、冲洗液,常用的稀释液有0.1%蛋白胨水溶液常用的冲洗液有氯化钠-蛋白胨缓冲液如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等以达到预处理的目的,中和剂或灭活剂,供试品有抑菌作用，可采用中和剂或灭活剂，消除供试品的抑菌作用,常见干扰物的中和剂或灭活方法,无菌检查法的方法验证,目的：证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查 是否有抑菌和干扰生长的现象验证方法： 直接接种法 薄膜过滤法,直接接种法,取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢
8、杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。这2只平行试管中的1管接入供试品，另1管作为对照，放规定的温度培养35天,薄膜过滤法,将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养35天。各试验菌同法操作。,结果判断：,与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可
9、以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,消除供试品抑菌的方法,增加冲洗量增加培养基的用量使用中和剂或灭活剂： -内酰胺酶、对氨基苯甲酸 更换滤膜品种注意：重新进行方法验证。,供试品的无菌检查,阳性对照,应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品
10、无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好。,阴性对照,供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照阴性对照不得有菌生长，如果有微生物生长，表明检验实验所使用的溶液、物品灭菌不彻底或者无菌操作过程遭受微生物污染,供试品无菌检查的接种方法,包括薄膜过滤接种法和直接接种法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法,水溶液供试品薄膜过滤接种法,取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将
11、100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用,可溶于水的固体制剂供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。 非水溶性制剂供试品：取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.11%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。,可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品：取规定
12、量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过 44，趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。 无菌气(喷)雾剂供试品：取规定量，将各容器置至少-20的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。,直接接种法,直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇
13、酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。,混悬液等非澄清水溶液供试品：取规定量，接种至各管培养基中。 固体制剂供试品：取规定量直接接种至各管培养基中。或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至各管培养基中。 非水溶性制剂供试品：取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的各管培养基中
14、。,无菌检查的培养及观察,上述含培养基的容器按规定的温度培养14天培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌,供试品无菌检查结果的判断,阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定,当符合下列至少一个条件时方可判试验结果
15、无效：,无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,Any questions?,微生物限度检查法,供试品未规定要求灭菌或者无菌是检查这些物品上微生物数量多少的方法微生物限度检查通过将样品接种至培养基中，菌落计数,供试液的制备,根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时，以免微生物在这个过程中受到过大影响、发生变化,具抑菌活性的供试品,消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。 培养基稀释法 将1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数 离心沉淀法 取一定量的供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。 薄膜过滤法中和法,
