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1、1幽门螺杆菌耐药的分子机理研究进展作者：喻海忠，许国莹，陈巧林，陈建国，苏兆亮【关键词】 幽门螺杆菌；抗生素类；抗药性幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP） 与胃、十二指肠疾病密切相关，是消化性溃疡、慢性活动性胃炎、十二指肠球部溃疡重要致病因素，也是胃癌演变的始动因子，与胃淋巴瘤的发生、发展有一定的关系1 。HP 清除直接关系到上述疾病的转归。但随着抗生素的广泛应用，其耐药率逐年上升。因此，探讨 HP 的耐药分子机理，对指导临床合理用药，有效控制 HP 相关疾病的传播有着十分重要的意义。1 HP 耐药性的产生治疗 HP 感染的药物有咪唑类如甲硝唑，大环内酯类如克拉霉素，-内
2、酰胺类如阿莫西林、喹诺酮类、四环素与硝基呋喃类等。关于 HP 耐药的起源，现代微生物学认为有两种可能性：自发突2变学说，即耐药性的产生是由于菌株的自发突变。根据达尔文的进化论，随着抗生素的应用，抗生素敏感的细菌逐渐减少而耐药菌逐渐增多；耐药遗传信息的传递产生了新的耐药株。染色体 DNA 或质粒基因上有控制耐药性的遗传信息，HP 耐药基因在细菌 DNA重组时进入敏感菌株，从而使耐药菌株增加。2 HP 耐药的分子机理细菌对抗生素的耐药可能与菌种的特性有关，也可能通过菌株的变异或者基因的转移获得，后者主要涉及到：细菌产生灭活酶或钝化酶；药物作用的靶位改变；细胞膜的渗透性改变；细菌对药物的外排和生物被
3、膜的形成。HP 对不同抗生素的耐药主要与以下机理有关：2.1 HP 对甲硝唑的耐药 甲硝唑是一种具有抑菌活性的药物前体，由于其氧化还原电势较低，易被硝基还原酶还原为亚硝基衍生物、羟氨衍生物，还原产物具有细胞毒性，使细菌 DNA 降解、断裂甚至导致细菌死亡。因其杀菌活性不受胃内低 pH 的影响，在胃腔内浓度高，具有较强的抗 HP 活性，因此常用于 HP 感染的一线治疗。但是近年来，随着甲硝唑的广泛使用，HP 对甲硝唑的耐药率逐年上升。在发达国家 HP 对甲硝唑的耐药率为 2030，而发展中国家高达 60%80%2，3 。HP 对甲硝唑耐药主要与3rdxA 基因突变导致该基因的失活有关， rdxA
4、 是编码氧不敏感的烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸硝基还原酶基因。但Kwon，Marais4， 5研究证实frxA、fdxA、fldA、fdxB、oorDABC 和 porCDAB 等基因也参与了 HP 对甲硝唑的耐药，并证实 frxA、fdxB 和 rdxA 基因的失活不会对 HP 产生致死效应，而 fdxA、fldA、oorDABC 和porCDAB 基因的失活却会导致 HP 的死亡，这可能与这些基因编码的蛋白为 HP 的存活提供了一个微需氧环境有关。同时也发现单一fdxB 基因突变导致 HP 对甲硝唑的低水平耐药甚至不导致耐药，但当 rdxA 基因与 fdxB 联合突变时将导致高水平耐药，而 f
5、rxA 或rdxA 基因的突变均会产生中等水平耐药，但当两者同时突变时则产生高水平耐药。国内李耿等6研究也表明 HP 对甲硝唑耐药不仅与 rdxA 有关，同时与 frxA、fdxB 基因突变有关。2.2 HP 对克拉霉素的耐药 克拉霉素又名 6-甲氧红霉素（甲红霉素） ，属于新一代大环内酯类药物。HP 对克拉霉素的耐药率地区差异明显，各国为 1%13%不等。Glupczynski 等7发现，儿童对克拉霉素的耐药率比成人高，这可能与儿童免疫力较成人低，而克拉霉素经常用于儿童呼吸道感染的治疗有关。HP 对克拉霉素的耐药主要为 23 SrRNA 可变区基因的突变导致核糖体变构，克拉霉素结合位点随之发
6、生改变，进而使 HP 与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白质合成，从而产生耐药性。但 23 SrDNA 的突4变位点和突变形式却具有地区差异8，9 。如中国东北地区，突变以 G2224A，C2245T 和 T2289C 为主，北京地区突变主要为A2143G 10 ，上海地区突变在 2144 位。但总的来说，A2143G的突变最为常见且稳定，占突变的 45.12%82.11% ，其它的突变形式有G2141A、 A2142G、 A2142C、A2142T、A2143C、G2115A，甚至在染色体的其它区段也发生突变。Fontana11等用 PCR 检测了 12 株耐克拉霉素菌株均未发现 23
7、 SrRNA 基因上的 2142 位点和2143 位点突变，却发现有 7 株耐药菌在 23 SrRNA 的恒定区发生了 T2717C 的突变，引起低水平耐药（ MIC=1g/ml） 。2.3 HP 对 -内酰胺类药物的耐药 常用于抗 HP 的 -内酰胺类药物为阿莫西林。-内酰胺类药物是通过与细菌内膜靶蛋白青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）结合，使转肽酶失活，破坏细菌细胞膜的完整性，使细菌死亡。HP 对阿莫西林的耐药率相对较低。以往研究认为，细菌对 -内酰胺类药物的耐药机理是：产生 -内酰胺酶、产生新的 PBPs、药物作用 PBPs 的位点改变、细
8、菌的渗透性降低以及自溶酶减少等。但是 HP 耐药菌株尚未检测到 -内酰胺酶，故推测 HP 对阿莫西林的耐药可能与其它机理有关。目前，已发现 3 种高分子量 PBPs（ PBP1、PBP2、PBP3）和 6 种低分子量 PBPs，其中 PBP1A 上转肽酶结构域的 4 个氨基酸突变引起 HP 对阿莫西林低水平耐药（MIC8g/ml） 12 ，5PBP1A 羧基端编码青霉素结合位点的 10 个氨基酸突变和细胞膜通透性改变，引起 HP 对阿莫西林中、高度耐药（ MIC8g/ml）13，14 。Dore15研究也发现 PBPs2D 缺失是 HP 对阿莫西林耐药的原因。也有报道12 ，在阿莫西林耐药菌株
9、的保守片段有 4 个 PBP1 的突变（ S414R，Y484C，T541I 和 P600T）和 1 个PBP2 突变（T498I ） ，其中 PBP2 单独突变不能引起耐药，而 PBP1单独突变能引起耐药，而两者一同突变并不能增强其耐药性。还有学者14认为多点突变可以导致耐药菌株的产生， Okamoto T14发现在两株突变菌株 PBP1 中的 ORF（开放阅读框）都有4 个氨基酸残基被替代和一个氨基酸残基的插入。2.4 HP 对喹诺酮类药物的耐药 喹诺酮类药物容易产生耐药，较少用于 HP 根除治疗。其耐药主要与 DNA 旋转酶（GYR）的改变和拓扑异构酶有关。DNA 旋转酶由 gyrA 基
10、因编码的 2 个 A 亚单位和 gyrB 基因编码的 2 个 B 亚单位组成的四聚体。此酶的主要功能是松解超螺旋 DNA，使之能复制。对大肠埃希菌的研究发现，细菌对喹诺酮类的高度耐药由 gyrA 的突变引起，而低度耐药由 gyrB突变引起。在对 HP 耐药菌株中也发现，gyrA 基因有 4 个位点发生突变（Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly、Asn 或 Tyr 取代、Ala97Val 取代） ，同时把耐药菌株的 gyrA 片段导入敏感菌株中从而使敏感菌株获得耐药性。因此，推论 gyrA 基因的突变是 HP 对喹诺酮类药物耐药的分子基础。62.5 HP 对利福霉素类药物的耐药
11、利福霉素类药物常用于抗结核病治疗，较少用于 HP 的治疗，该类抗生素对细菌的作用靶位是依赖 DNA 的 RNA 聚合酶，此酶由 rpoB 基因编码。Heep16经过一系列体外筛选获得了 HP ATCC43504 耐药株，对 rpoB 基因克隆、测序进行突变分析，发现所有耐药突变均包含密码子 524-545 和密码子 586 在内的基因簇区域。并发现利福平耐药株与野生型 rpoB 基因相同，只是在扩增 54-916 碱基对时，有一个密码子的改变，即 V149F。从耐药株扩增的 rpoB 基因片段导入到敏感株中，在选择培养基上长出了耐利福平的 HP。从而推论，HP 对利福霉素的耐药与 rpoB 可
12、能有一定的关系。但确切的机理有待进一步研究证实。2.6 HP 对四环素的耐药 四环素因其价廉有效而用于 HP 感染治疗，但近年来发现该药易引起二重感染，且其耐药率也呈上升趋势，现较少用于临床。四环素主要作用于细菌核蛋白体，阻止mRNA 核蛋白体复合物 A 位与氨基酰 tRNA 的结合，从而抑制始动复合物的形成及肽链的延伸，并阻止核蛋白体与终止密码结合，抑制已合成的肽链或蛋白质释放。16 SrRNA 的突变是 HP 对四环素耐药的主要原因，其中最常见的突变为 16 SrRNA AGA（965967 ）TTC 的突变。Nonaka 等17证明 16 SrRNA 965-967 位，单个、两个或者三
13、个碱基的突变都会导致 HP对四环素的耐药，Wu JY 等18也证明 54%耐药菌株是单一位7点突变（如 CGA、GGA、TGA、AGC、AGT） ，这可能是由于这些碱基的改变，影响了 16 SrRNA 的结构所致。Lawson 等19 在1006 株分离菌株中发现 18 株对四环素敏感性降低，其中有 3 株耐药（MIC4mg/L） ；敏感性降低的 18 株中有 10 株检测到 16 SrRNA 突变：一株存在 A926T 和 A928C 的双重突变，一株A926C 突变，一株 A928C 突变，另外七株为 A926G 突变。3 结语目前，虽然对 HP 的耐药性有所研究并取得了一定的进展，但仍存
14、在着许多问题，如耐药机理的不确定性；抗生素的使用剂量、用药史、年龄、性别等在 HP 对抗生素耐药中的确切作用仍不清楚。因此，加强临床菌株的耐药性研究，深入探讨 HP 耐药机理与特性，为指导临床合理用药以及抗生素的开发提供了新的思路。【参考文献】1 Williamson JS.Helicobacter pylori： current chemotherapy and new targets for drug design J.Curr Pharm Des，2001，7（5 ）：355-392.2 Gorgoulis V，Rassidakis G，Karameris A，et al.Express
15、ion of p53 protein in laryngeal squamous cell 8carcinoma and dysplasia： possible correlation with human papillomavirus infection and clinicopathological findings J.Virchows Arch，1994 ，425 （5）：481-489.3 叶嗣颖，田拥军，刘南植，等.幽门螺杆菌耐甲硝唑基因分型与序列分析J.中华微生物学和免疫学杂志，2002，22 （ 4）：447-450.4 Kwon DH，EI-Zaatari FA， Kato
16、M，et al.Analysis of rdxA and involvement of additional genes encoding NAD（P）H flavin oxidoreductase （FrxA） and ferredoxin-like protein （FdxB） in metronidazole resistance of Helicobacter pylori J .Antimicrob Agents Chemother，2000，44（8）：2133-2142.5 Marais A，Bilardi C，Cantet F，et al.Characterization of the genes rdxA and frxA involved in metronidazole resistance in Helicoba
