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1、IgG 的分离与提纯：硫酸铵沉淀法发布时间： 2009-02-12 新闻来源：以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球 蛋白 组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球 蛋白 必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清 蛋白 。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球 蛋白 特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球 蛋白 。 球 蛋白 （ IgG ）是血清免疫球 蛋白 的主要成分，约占全部免疫球 蛋白 的 75% ，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化 IgG 。纯化 IgG 小量几十 ml 的话，用 p
2、rotein A 或 protein G 就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百 ml，可以使用 streamline protein A 。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铵沉淀后过 DEAE 纤维素柱， 比较简便可获较纯的抗体。 下面以此方法为例介绍 IgG 的分离与提纯。一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g850g H2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以 28 NH4OH 调 pH 至 7.0（不调 pH 值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对 蛋白 质巯基有影响。如次品
3、必须除去重金属，可在溶液中通入 H 2S，静置过夜后滤过，加热蒸发 H2S 即可。3、 0.01Mol/L pH7.4PB 液A 液： 0.10Mol/L NaH 2PO 4 液NaH 2PO4 2H2O 15.60g 加 H 2O 至 1000.ml B 液： 0.10Mol/L Na 2HPO 4 液Na 2HPO 4 12H 2O 35.80g 加 H 2O 至 1 000ml 取 A 液 19ml ， B 液 81ml 加水至 1000ml 即可。4、 1%BaCl2 溶液5、纳氏液HgI 115.00g KI 80.00g 加 H 2O 至 500.00ml 溶化后过滤，然后再加 2
4、0%NaOH500.00ml ，混合即可。6、 0.50 Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液7、洗脱液0.03Mol/L 的 NaCl 液。8、透析袋（或玻璃纸）二、操作方法1、取 20ml 血清，加生理盐水 20ml ，再逐滴加入（ NH4 ） 2SO4 饱和溶液 10ml ，使成 20% （ NH4 ） 2SO 4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置 30min 。2、 3000r/min 离心 20min ，弃去沉淀，以除去纤维 蛋白 。3、在上清液中再加（ NH4 ） 2SO4 饱和溶液 30ml ，使成 50%（ NH4 ） 2SO4 溶液，充分混合，
5、静置 30min 。4、 3000r/min 离心 20min ，弃上清。5、于沉淀中加 20ml 生理盐水，使之溶解，再加（ NH4 ） 2SO 4 饱和溶液 10ml ，使成 33% （ NH4 ） 2SO 4溶液，充分混合后，静置 30min 。6、 3000r/min 离心 20min ，弃上清，以除去白 蛋白 。重复步骤 5， 23 次。7、用 10ml 生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。8、透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于 4透析 24h ，中间换液数次。以 1%BaCl2 检查透析液中的 SO42- 或以纳氏试剂检查 NH4 （取 34ml 透析液，加试剂 12 滴，出现
6、砖红色即认为有 NH4 存在），直至无 SO42- 或 NH4 出现为止。也可采用 SephadexG25 或电透析除盐。9、离心去沉淀（去除杂 蛋白 ），上清液即为粗提 IgG （即 球 蛋白 ，如以 36% 的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球 蛋白 ， Euglobin ，含 球 蛋白 ）。10、过 DEAE 纤维素层析柱。以 0.01Mol/L pH7.4PBS （ 0.03Mol/L NaCl ）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150 或 G200 柱。11、 蛋白 质及其定量鉴定。12、 IgG 的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。（ 1）区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均
7、可。加样电泳后，只在 球 蛋白 的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（ NH4 ） 2SO 4 盐析样品进行电泳，以资比较。（ 2）琼脂双相双扩散鉴定预先准备该 IgG 免疫异种动物所获的抗 IgG 血清。 将 IgG 与抗 IgG 血清进行双相双扩散， 如 IgG 提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。（ 3）免疫电泳鉴定孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗 IgG 血清，琼脂扩散 24h ，观察结果。如果提取的 IgG 纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于 球 蛋白 区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。（ 4）圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的 IgG 则只有一条区带。13、 IgG 的浓缩与保存（ 1） IgG 的浓缩（ 2） IgG 的保存一般浓缩至 1% 以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加 0.01 硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
