《三七总皂甙抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用及其机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三七总皂甙抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用及其机制的研究（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1三七总皂甙抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用及其机制的研究作者：程志清 徐百鸿 窦丽萍 刘旺 王娟【摘要 】 目的探讨三七总皂甙（ PNS）抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用及其可能的机制。 方法通过反复感染柯萨奇病毒建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型，采用 HE 和 VG 染色观察心肌病变和纤维增生情况，采用病理检验方法对心肌胶原容积分数（CVF ）和心肌血管周围胶原面积（PVCA）进行检测，并采用免疫组化法及 RTPCR 法检测心肌中 TGF1 蛋白及其 mRNA 表达水平。 结果病毒性心肌炎慢性期模型组小鼠心脏出现明显心肌纤维化，与正常组比较，CVF 和 PVCA 均显著增加（
2、P0.01） ，模型组心肌中 TGF1 蛋白及其 mRNA 表达水平均较正常组明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义（P0.01） ；三七总皂甙治疗组可以减轻心肌病变程度，CVF 和 PVCA 示三七总皂甙各治疗组心脏中胶原比模型组均明显减少，并且三七总皂甙治疗组心肌中 TGF1 蛋白及其 mRNA 表达水平较模型组下降。 结论三七总皂甙能下调病毒性心肌炎慢性期 TGF1 的表达，抑制心肌胶原的增生，提示其抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用可能部分通过抑制 PDGFBB 过度表达有关。 2【关键词】 三七总皂甙；心肌纤维化；转化生长因子；病毒性心肌炎Abstract： ObjectiveT
3、o study the mechanisms and effects of panax notoginsenosides(PNS) on myocardial fibrosis in chronic viral myocarditic(VMC) mice.Methods The model mice with VMC at chronic status were established by repetitive infection of Coxsckievirus B3m(CVB3m).Heart changes of myocardium and collagen hyperplasia
4、were observed by HE and VG stain.Collagen volume fraction (CVF) and perivascular circuferential area (PVCA) were examined by pathological examination with computed processing.Myocardium TGF1 was detected by immunohistochemical method and mRNA expression of TGF1 was analyzed by Reverse transcription
5、polymerase chain reaction (RTPCR) method.ResultsMarked myocardial fibrosis was observed in chronic VMC model group.Compared with blank group， the index of CVF and PVCA was increased significantly（P0.01）.TGF1 immunohistochemical staining and TGF1 mRNA levels in VMC model group was significantly incre
6、ased than the blank 3group(P0.01);Compared with chronic VMC model group，pathological changes of myocardium relieved in PNS treated group.The index of CVF and PVCA was decreased in PNS treated group.Further，TGF1 immunohistochemical staining and TGF1 mRNA levels in PNStreated group were decreased than
7、 chronic VMC model group.ConclusionPNS inhibit TGF1 protein and mRNA overexpression in myocardium of chronic VMC mice，and reduce collagen synthesis,suggesting that its mechanism may be partly inhibiting TGF1 protein and mRNA overexpression in myocardium.Key words: panax notoginsenosides;myocardial f
8、ibrosis;TGF1;viral myocarditis病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）慢性期心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）的发病机理复杂，目前尚未发现针对性的治疗药物。现在较为肯定的具有抗心肌纤维化的药物有血管紧张素转化酶抑制剂 ACEI12 ,醛固酮拮抗剂 3 、钙拮抗剂等4 ，但是由于作用单一、不良反应及价格等因素影响了临床应用。4因此很多学者开始广泛研究中药对病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用，并取得了一些进展。三七总皂甙（Panax notoginsenosides，PNS）是五加科人参属植物三七根部提取的有效成分，现代研究发
9、现 PNS 不但可以抑制组织纤维化的作用57 ，而且还具有保护心肌8 、抗心率失常9及调解免疫10等作用。上述作用强烈提示 PNS 可能是治疗 VMC 慢性期心肌纤维化的理想药物，但目前还没有得到直接的实验和临床支持，国内外也没有相应的文献报道。本实验将观察 PNS 对 VMC 慢性期心肌纤维化的干预作用及对 TGF1 表达的影响，探讨 PNS 抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用及其机制。1 材料和方法1.2 材料 (1)病毒:柯萨奇 B3 病毒(Nancy 株，Hep2 细胞上测定 TCID50=10-5)，由复旦大学医学院附属中山医院病毒性心肌炎重点实验室提供。(2)动物 雄性 Balb
10、/c 小鼠，56 周龄，体重 1618g。购自中国科学院上海实验动物中心。 (3)药物与试剂 PNS 由云南玉溪市维和制药有限公司提供；免疫组化检测试剂盒EnVisionTM TwoStep Histostaining Reagent Lot:00002568101 为丹麦 DAKO 公司的产品； TGF1 为 Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度均为 150，为武汉博士德生物公司的产品；Trizol 及逆转录试剂盒：购于上海 Sangon 生物工程技术5公司；PCR 试剂盒：购于大连宝生物工程有限公司；引物：上海Sangon 生物工程技术公司合成。1.2 方法1.2.1 VMC 慢性期心肌
11、纤维化模型的建立、分组及给药 雄性 BALB/c 小鼠 88 只，随机先分出正常对照组(N 组)8 只，腹腔注射无病毒 EaglesMEM 液 0.1ml/只。其余 80 只腹腔接种含12000 的 100TCID50 加 CVB3 的 EaglesMEM 液 0.1ml只，以后每 2 周注射 1 次，共 3 次(每次病毒液浓度是前一次的 2 倍，注射液体量不变)，以建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的小鼠模型，60 天后存活小鼠随机分组并开始给药。分组：模型对照组： M组；三七总皂甙高剂量治疗组：T1 组；三七总皂甙中剂量治疗组：T2 组；三七总皂甙低剂量治疗组：T3 组。给药方式：N 组和
12、M 组以蒸馏水 0.2mL只灌胃作为安慰用药，T1 组每只小鼠以每天0.6g kg 的剂量给药 0.2ml，T2 组以每只小鼠每天 0.4gkg 的剂量给药 0.2ml，T3 组以每只小鼠每天 0.2gkg 的剂量给药0.2ml。每日灌胃 1 次，用药 45 天后处死动物作检测。1.2.2 标本采集 脱颈椎处死小鼠后，立即取心脏分为两部分，第一部分：取心尖、右心室（预实验发现右心室病变较左心室重）和室间隔部，放入预先消毒和 DEPC 处理过的冻存管中立即置于液6氮中，用作 RTPCR 实验。第二部分：剩余部分心肌（保证有左右心室和室间隔）立即放在 10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定液中
13、固定，做石蜡包埋和切片。1.2.3 HE 与 VG 染色及 CVF、PVCA 测定 取右心室中段横断面心肌组织，常规固定、包埋和制片，进行 HE 染色和 VG 染色，以清晰显示心肌细胞和胶原组织，光镜下观察组织形态学改变。应用 HPIAS1000 型图象分析仪，在 VG 染色下测量心肌容积分数(CVF)和心肌血管周围胶原面积 (PVCA)。通过灰度调节来区别胶原和非胶原成分。计算方法：CVF= 胶原面积/ 总面积，其中胶原面积不包含血管周围胶原面积。随机分析 5 个视野，取其均值作为该部位的 CVF。 PVCA=心室壁内小动脉管腔周围胶原面积/ 动脉管腔面积。每一标本取 4 根壁内小动脉横切面
14、进行测量，取其均值作为该部位的 PVCA。1.2.4 心肌组织 TGF1 的检测 取石蜡切片常规脱蜡入水，3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶 10 分钟，PBS 洗 5 分钟3 次，滴加一抗，4过夜。 TGF1 为 Rabbit 来源的多克隆抗体，工作浓度为 150，为武汉博士德生物公司的产品； PBS 冲洗，5 分钟3 次，滴加山羊抗兔 IgG 抗体HRP 多聚体，37孵育40min，PBS 冲洗，5min3 次，DAB 显色液显色 1-3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应，Harris 苏木素液复染细胞核71min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用武汉同济
15、千屏影像工程公司 HPIAS1000 病理图文分析系统采集图像，半定量分析 TGF1 的表达情况。即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采用 HPIAS1000 病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集 5 个视野（ 200 倍） ，经过该系统自动分析获得该5 个视野的 5 个平均光密度值，经计算机平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析。1.2.5 心肌组织 TGF1mRNA 含量测定 Trizol 一步法抽提总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见 5S、18S 和 28S 三条带, 说明RNA 完整没有降解，可作为逆转录反应的模板。通过逆转录合成cDNA。取 RNA 抽提液 2L
16、 加 98L 无 RNA 酶去离子水混匀，Du640 紫外分光光度仪测 OD260/OD280，检测核酸浓度，计算核酸量。TGF1 上游引物为 5GAGGGGGAGGAGGAGTGGGA3 ，下游引物为 5CCGGGTAGCGATCGAGTGTC3 ，产物长度 169bp；GAPDH 上游 5 GAGGCCGGTGCTGAGTATGT 3，下游 5 CTTCTGGGTGGCAGTGATGG 3，产物长度 294bp；TGF1 的反应条件：95，5 分，预变性；94，30 秒，变性；61，20秒，退火；72，20 秒，延伸；72，7 分，终末延伸；35 个循环，4保温；GAPDH 的反应条件：95，5 分，预变性；94，30 秒，变性；60，20 秒，退火；
