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1、1CRBP-1 基因 RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟 【摘要 】 目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ，CRBP-1)基因 RNAi（RNA interference， RNAi）慢病毒载体。方法：针对已经筛选确定的大鼠 CRBP-1 基因 RNAi 有效靶序列，合成靶序列的 Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经 Hpa I 和 Xho I 酶切后的 pGCL-GFP 载体连接产生短发卡 RNA 慢病毒载体， PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。结果：PCR 鉴定与 DNA
2、 测序证实合成的含 CRBP-1 shRNA 慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论：成功构建大鼠 CRBP-1 基因 RNAi 慢病毒载体。 【关键词】 RNA 干扰；视黄醇结合蛋白-1 ；慢病毒Abstract Objective：To construct a lentiviral vector of RNA interference（RNAi ） of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods：The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was c
3、onfirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and 2antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed，synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector，to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA)， and it was identified by PCR and DNA
4、sequencing. Results：PCR identification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right. Conclusion：The lentivirus RNAi vector of rat CRBP-I was constructed successfully.Key words RNA interference；Cellular retinol-bindi
5、ng protein I；Lentivirus肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节1，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002 年 Uchio K2在用 CCl4 制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第 5 天的 HSC 中 CRBP-1 表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示 CRBP-1 与肌成纤维样细胞的形成密切相关。近年来，随着 RNAi 技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取 CRBP-1 基因的RNAi 有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达 CRBP-1 s
6、hRNA 的慢病毒载体，为后期研究 CRBP-1 基因在 HSC 活化中的3作用机制和肝纤维化的基因治疗打下基础。1 材料和方法1.1 材料 PCR 用试剂 primer、dsDNA Oligo （上海吉凯基因技术有限公司合成） ，大肠杆菌菌株 DH5，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（ Invitrogen 公司） 。慢病毒载体系统（ Tronolab 公司 www. tronolab. com/ lentivectors.php）. 该病毒包装系统由pGCL-GFP 载体，pHelper 1.0(gag/pol 元件)载体，Helper 2.0 (VSVG 元件)载体三质粒组成，其中 pGCL
7、-GFP 载体含有能持续表达小 RNA 的元件，同时能表达荧光蛋白 marker(GFP/RFP)，pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 含有病毒包装所必须的元件。 限制性内切酶、T4DNA 连接酶（New England Biolabs 公司） 。1.2 方法1.2.1 双链 DNA Oligo 制备 用 Ambion 公司的设计软件，设计、合成 3 对针对 CRBP-1 基因 shRNA 的寡核苷酸序列，经分别构建质粒，转染 293 细胞，据其对 CRBP-1 的抑制率，确定有效靶序列：Pscsi-1:CCGCAAGTGCATGACCACA， （CRBP-1 mRNA NM_
8、012733，GenBank GI:77416367）. 设计并合成其 shRNA的 DNA Oligo：Pscsi495-1：5- CCGGGACC-4CAAGTGCATGACCACACTCGAGTGTGGTCATGCA-CTTGCGGTCTTTTTG-3，Pscsi495-2：5- AATTGA-AAAAGACCGCAAGTGCATGACCACACTCGAGTGT-GGTCATGCACTTGCGGTC -3，经退火形成双链 DNA。退火反应体系：DNA Oligo(sense) (1g/l) 5l，DNA Oligo(antisense)(1 g/l) 5 l，5Universal Buf
9、fer 20 l，ddH2O 70 l。混匀，904 min，70 10 min，缓慢冷却至室温。12%非变性 PAGE 凝胶检测双链 DNA Oligo 形成效率。1.2.2 构建表达 shRNA 慢病毒载体 Hpa I 和 Xho I 酶切pGCL-GFP 载体以使其线性化，经退火形成双链 DNA 与双酶切后的 pGCL-GFP 载体连接。连接反应体系：酶切回收的载体DNA（100 ng/l）1 l，退火的双链 DNA（100 ng/l）1 l，10T4 噬菌体 DNA 连接酶缓冲液 1 l，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1 l，dd H2O 7 l，于 4 连接 12 h，37振摇 16
10、 h 转化到DH5。1.2.3 PCR 鉴定及 DNA 测序 挑取重组阳性克隆行 PCR 及 DNA测序鉴定。PCR 鉴定阳性克隆的上游引物： 5-5CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，下游引物： 5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。PCR 体系见表 1，PCR 反应条件：94变性 30 s，94 30 s，60 30s，72 30 s，循环 30次，72延伸 6 min。挑选 1 号阳性克隆菌液测序。2 结 果2.1 12%PAEG 非变性 PAGE 凝胶检测双链 DNA Oligo 形成效率 PAGE 电泳见图 1。2.2 阳性克隆的 PCR 鉴定 琼脂糖凝
11、胶电泳见图 2，PCR 条带大小：连接入 vshRNA 片段的阳性克隆 PCR 片段大小为：384bp；没有连接入 vshRNA 片段的空载体克隆 PCR 片段大小为：322bp。2.3 DNA 测序鉴定 DNA 测序鉴定的结果与实验要求的 DNA 序列基本一致（图 3） 。3 讨 论RNAi 技术成为一种新的反向遗传学手段，被广泛地应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因治疗。质粒介导 RNAi 有一定6的局限性，转染率低，基因抑制表达作用弱，持续时间短3，不适合体内实验。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，以HIV-1 为基础发展而得，具有许多优点，能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞
12、，而且病毒的遗传物质能够整合到宿主的基因组，转移基因片段容量较大，慢病毒载体 RNAi 作用持久，不易诱发宿主免疫反应，因此慢病毒载体是当前基因治疗载体研究的热点4，用慢病毒载体介导 RNAi 的几项体内外研究5，6即显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义。HSC 向 MFB 分化、维生素 A 脂滴的消失与 HSC 激活有何关联，是激活时重要的分子机制之一，还是仅仅为一种伴随现象。这些都是需要进一步探讨的问题，这些问题的阐明对于临床上治疗肝纤维化具有重要意义。Lepreux 等7 在人肝纤维化的研究提示 CRBP-1基因是肝星状细胞活化信号通路中重要组成部分，何天霖等
13、8的研究表明 CRBP-1 基因在大鼠肝纤维化早期和持续活化组中均明显上调。基于目前国内外有关 HSC 早期激活阶段视黄醇代谢途径的研究较少，我们在筛选出 CRBP-1 基因 RNAi 的有效靶序列后，构建表达 shRNA 慢病毒载体，以进一步研究沉默 CRBP-1 基因对 HSC生物学行为的影响并探讨其机制。为构建 CRBP-1shRNA 慢病毒载体，购买了病毒包装系统 pGCL-GFP，pHelper 1.0 (gag/pol 元件)，Helper 2.0 (VSVG 元件)载体三质粒，其中 pGCL-GFP 载体含有能持续表达小 RNA 的元件，同时能表达荧光蛋白 marker(GFP/
14、RFP)，7可用于病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper 1.0 质粒中含有 HIV 病毒的 gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白; pol 基因，编码病毒特异性的酶；rev 基因，编码调节 gag和 pol 基因表达的调节因子。pHelper 2.0 质粒中含有单纯疱疹病毒来源的 VSVg 基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。本实验经PCR 筛选阳性克隆测序鉴定表明，成功构建了含有 GFP 报告基因的大鼠 CRBP-1 基因 shRNA 慢病毒载体，为进一步研究 CRBP-1 基因在肝纤维化的作用机制和动物基因治疗奠定了基础。【参考文献】1 Friedman S
15、L. Molecular regulation of hepatic fibrosis， an integrated cellular response to tissue injuryJ. J Biol Chem，2000， 275（4）:2247-2250. 2 Uchio K.Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and por
16、tal fibroblastsJ. Lab Invest，2002，82(5):619-628.3 Jazag A， Ijichi H， Kanai F， et al. Smad4 silencing in 8pancreatic cancer cell lines using stable RNA interference and gene expression profiles induced by transforming growth factor-J. Oncogene， 2005， 24(4): 662 - 671.4 Morris KV， Rossi JJ. Lentiviral mediated delivery of siRNAs for antiviral therapyJ. Gene Ther， 2006， 13（6）:553-558.5 S
