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1、1CpG ODN 联合 HBsAg 免疫 BALB/c 小鼠和HBV 转基因 C57BL/6J 小鼠【关键词】 乙型CpG oligodeoxyribonucleotide with hepatitis B surface antigen (HBsAg) for vaccination in BALB/c and HBVtransgenic mice【Abstract】AIM： To study the effects of CpG oligodeoxyribonucleotide (ODN) as adjuvant on the immune responses in BALB/c and
2、HBV-transgenic mice with hepatitis B surface antigen (HBsAg). METHODS: BALB/c and HBV transgenic mice were immunized by multiplesite intramuscular injection with HBsAg and phosphorothioate oligodeoxynucleotides containing two CpG motifs. The HBsAg and antiHBs in serum from immunized mice were detect
3、ed by ELISA and the number of IFNsecreting T cells was examined by ELISPOT. RESULTS: In BALB/c mice, the mice immunized with CpG ODN plus HBsAg showed higher specific humoral immune responses to HBsAg than those immunized with HBsAg alone. Compared with the 2immunization with HBsAg or CpG ODN alone,
4、 the immunization with HBsAg plus CpG ODN activated respectively 3 or 9 times more HBs-specific IFNsecreting T cells. In HBV transgenic mice, antiHBs in serum were detected in the mice immunized with HBsAg and CpG ODN while no antiHBs in serum in the mice immunized with HBsAg or CpG ODN alone. There
5、 was no significant difference in the level of HBsAg in serum between the three groups after vaccination (P0.05) but the level declined in all three groups compared with those prevaccination (P0.05). Compared with the immunization with HBsAg or CpG ODN alone, the immunization with HBsAg plus CpG ODN
6、 activated, respectively, 3 or 11 times more HBsspecific IFNsecreting T cells. CONCLUSION: CpG ODN can act as adjuvant to enhance the humoral and cell immune responses in BALB/c mice immunized with HBsAg. CpG ODN oligodeoxyribonucleotide combined with HBsAg can break the tolerance to this antigen in
7、 HBV transgenic mice and may become a potential prophylactic and therapeutic approach. 【Keywords】 CpG ODN; hepatitis B surface antigens (HBsAg); mice, inbred BALB/C; mice， transgenic; immune 3response【摘要】目的： 探讨人工合成硫代修饰的含 CpG 基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对 HBsAg 诱导 BALB/c 和 HBV 转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法： 用人工合成 CpG ODN
8、 与血源HBsAg 联合免疫 BALB/c 和 HBV 转基因 C57BL/6J 小鼠，采用ELISA 方法观察小鼠血清 HBsAg 及抗 HBs 水平，用 ELISPOT 方法判断 CpG ODN 对 HBsAg 免疫小鼠脾 T 淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果： CpG ODN 联合 HBsAg 免疫 BALB/c 小鼠较 HBsAg单独注射组同期抗 HBs 滴度明显提高，尤其在首次免疫后6、8 、12 wk，2 组比较差异显著（P005） ，联合免疫较 CpG ODN 单独免疫自首次免疫后 4 16 wk 差异显著（P005）. 与HBsAg，CpG ODN 单独免疫比较，联合免疫能使
9、 HBsAg 特异性分泌 IFN T 细胞分别增加 3 或 9 倍；CpG ODN，HBsAg 联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗 HBs，随时间延长，抗体滴度逐渐升高，并能使更多小鼠产生抗体，而单用 HBsAg 组、CpG ODN 组均不能诱导抗 HBs 的产生，免疫后各组血清 HBsAg 浓度较免疫前明显下降(P 005） ，与HBsAg，CpG ODN 单独免疫比较，联合免疫能使 HBsAg 特异性分泌 IFN T 细胞分别增加 3 或 11 倍. 结论： CpG ODN 作为佐剂可增强 HBsAg 诱导 BALB/c 小鼠产生体液及细胞免疫应答，CpG ODN ，HBsAg 联合免疫可打破
10、 HBV 转基因小鼠对 HBsAg 免疫耐4受，可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.【关键词】 CpG ODN；肝炎型表面抗原（ HBsAg） ，乙型；小鼠，近交 BALB/c； 小鼠，转基因； 免疫应答0 引言目前，应用于慢性乙型肝炎治疗且具有持久疗效的药物只有IFN，持续应答率仅 30%左右.因此，急需开发新的治疗措施.含CpG 基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对天然和获得性免疫系统具有广泛的刺激作用，在动物体内可作为多种外源抗原（包括HBsAg）的 Th1 型免疫佐剂，达到增强体液免疫及细胞免疫的作用1,2 ，CpG ODN 联合 HBsAg 可望成为慢性乙型肝炎的有效治疗性
11、疫苗.为此，我们将人工合成硫代修饰的含 CpG 基序的寡脱氧核苷酸 CpG ODN 联合 HBsAg 在 BALB/c 小鼠和转基因小鼠体内进行了实验研究.1 材料和方法11 材料BALB/c 小鼠 56 只，HBV 转基因成功小鼠 56 只，均为雌性，568 周龄，购自北京大学医学部实验动物科学部，转基因小鼠全称为 C57BL/6JTgN（A1b1HBV）44Bri，引种自美国 Jackson 实验室. 所转移的基因包括 HBV S，PreS 及 X 基因，转入的 HBV 基因为Ayw 亚型，血清 HBsAg 阳性，可稳定垂直传代.全部清洁级小鼠均在北京大学医学部实验动物科学部无菌饲养.HB
12、sAg 为北大人民医院肝病研究所提取血源抗原，溶解状态，不含铝佐剂，终浓度 5 g/L；含 CpG 的 ODN（序列 1826 5TCCATGACGTTCCTGACGTT3划线部分为小鼠最佳 CpG 基序） ，上海生工生物工程公司合成，全链硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，溶于生理盐水使用.12 方法用 1 mL 的 OT 注射器（25 号针头）行双后肢多点im，HBsAg 10 g，CpG ODN 50 g，每半月免疫 1 次，共 3 次.两种小鼠实验分组相同. HBsAg 联合 CpG ODN 组 12 只（研究目的组） ，注射前将二者充分混匀， HBsAg 组 12 只（阳性对照组） ，
13、 CpG ODN 组 8 只（阴性对照组）小鼠 .分别于免疫前及首次免疫后 2，4，6，8，12，16 wk 经鼠尾静脉采血, HBV 转基因小鼠分别于免疫前，首次免疫后 1，3 ，6 mo 经眶后静脉丛穿刺采血，每次采血 0305 mL，13000 r/min，10 min，收集上清置-20冰箱保存备用.另取同品系 BALB/c 小鼠和转基因小鼠各 24 只，6分组、接种剂量同上，各 8 只，每半月免疫 1 次，共 2 次，末次免疫后 2 wk 处死小鼠，无菌状态取脾制备脾细胞悬液，用 ELISPOT检测小鼠 HBsAg 特异性分泌 IFN T 细胞数量 .血清 HBsAg 及抗HBs 的检
14、测用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测血清 HBsAg 及抗 HBs，试剂盒购自美国雅培公司，操作按说明书进行. 检测BALB/c 小鼠抗 HBs 试剂盒购自北京万泰实业有限公司，操作按说明书进行，测定吸光度（A）值 A450nm (临界值为 010) .小鼠细胞因子分泌 T 细胞数量用固相酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测，操作按说明书进行，试剂盒购自法国 DiaClone 公司.统计学处理：运用 SAS81 进行统计分析.抗 HBs 检测结果及血清平均 HBsAg 浓度采用重复测量方差分析，P005 表明差异具有显著性.2 结果21BALB/c 小鼠产生抗 HBs（所有标本 25
15、倍稀释）HBsAg单独注射组抗 HBs 滴度随时间逐渐增高，至首次免疫后 16 wk 达高峰，CpG ODN 联合 HBsAg 诱导抗体效价随时间逐渐增高，首次免疫后 8 wk 达高峰，之后呈下降趋势，在同期较 HBsAg 单独注射升高，尤其在首次免疫后 6、8 、12 wk 两组比较差异显著（P005） ，联合免疫较 CpG ODN 单独免疫自首次免疫后7416 wk 差异显著（P10 U/L 为阳性）CpG ODN 联合 HBsAg 组小鼠抗 HBs 在首次免疫后 1 mo 有 3 只阳性，几何均数为 376，3 mo 有 7 只阳性，几何均数为 2294，6 mo 有9 只阳性，几何均数
16、为 14470 (Tab 2)，呈逐渐升高趋势，而HBsAg 组 12 只小鼠及寡脱氧核苷酸组 8 只小鼠在免疫后各时间点抗 HBs 均阴性. 表 2 转基因小鼠免疫前后血清平均 HBsAg 浓度(S/N) 变化（略）23HBV 转基因小鼠循环 HBsAg（2 为阳性）各组小鼠血清 HBsAg 免疫前全部阳性，免疫后 1，3,6 mo 各组血清 HBsAg均下降, OS 组下降更明显，第 1 时间点与后 3 个时间点间有统计学差异（F=4545,00001） ，各个时间点 3 组之间无统计学差异（F=271, P =00836，Tab 3）. 24BALB/c 小鼠细胞因子分泌 T 细胞我们采用抗 IFN E
