《BrdU, CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BrdU, CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1BrdU, CFSE 和 GFP 标记大鼠间充质干细胞的比较作者：付霞霏，何援利，杨芳，彭冬先，刘木彪 【摘要 】 目的: 研究 BrdU, CFSE 和 GFP 作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性. 方法: 分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞，检测即时、15 和 30 d 的标记率，通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线，来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响；通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志（CD29, CD34, CD44, CD45）表达的影响. 结果: BrdU, CFSE, GFP 的即时标记率为 77.0%, 99.4%, 89.7%，1 mo 后分别
2、下降至 51.9%, 77.5%, 82.9%. 三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响. 结论: GFP, BrdU 和 CFSE 均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物. 【关键词】 绿色荧光蛋白；溴脱氧尿嘧啶核苷；荧光染料CFSE；间充质干细胞【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of labeling of BrdU, CFSE and GFP as labels of rat mesenchymal stem cells (MSCs) and to investigate the influence
3、of the 3 2markers on the growth characteristics and expressions of surface markers of rat MSCs. METHODS: Wistar rats bone marrow derived MSCs were isolated and purified in vitro by Percoll density gradient centrifugation combined with adherent method and were labeled with BrdU, CFSE and GFP, respect
4、ively. The immediate, 15day and 30day labeling efficiency of the 3 markers was quantified. The labeling efficiency of BrdU was detected with immunocytochemical method, and that of CFSE and GFP was detected via flow cytometry (FCM). The labeled MSCs were observed under microscope. Cell cycle and apop
5、tosis rate of labeled MSCs were revealed and the growth curves were delineated, so as to identify whether or not the markers casted an influence on the cell growth characteristics in vitro. Furthermore, the surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45) of the labeled MSCs were detected through flow cytom
6、etry and were compared with those of nonlabeled MSCs. RESULTS: The immediate labeling efficiency of BrdU, CFSE, and GFP was 77.0%, 99.4%, 89.7% respectively, and the efficiency decreased to 51.9%, 77.5%, and 82.9% respectively after 30 d. There was no statistical difference in cell cycle and apoptos
7、is ratio between labeled MSCs and nonlabeled MSCs. The 3growth curves of labeled MSCs were similar to that of nonlabeled MSCs. The 3 markers didnt influence the expressions of surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45) of rat MSCs. CONCLUSION: The 3 markers have no effects on the growth characteristic
8、s and expressions of surface markers of rat MSCs cultured in vitro. BrdU, CFSE and GFP can serve as labeling markers of rat MSCs. BrdU and CFSE labeling can be used for short time tracing, and GFP labeling for long time tracing.【Keywords】 GFP; BrdU; CFSE; MSCs0 引言骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC
9、s）是定居于骨髓微环境中的一种成体干细胞. MSCs 不仅能分泌多种细胞因子调节造血细胞的增生与分化，还具有自我增殖、多向分化的潜能1. 因其采集方法简单、能在体外大量扩增、可自体移植避免免疫排斥和伦理问题，已成为组织修复的理想种子细胞和基因治疗的靶细胞2. 而寻找合适的标记方法用于追踪观察 MSCs 在实验研究中是很重要的. 目前常用的标记方法包括：溴脱氧尿嘧啶（5bromodeoxyuridine, BrdU） 、荧光染料（如二醋酸盐琥珀酰4亚胺酯，5,6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）和绿色荧光蛋白（green f
10、luorescent protein，GFP）标记. 我们从标记率、MSCs 的生物学特性和表面标志的表达等方面对这三种标记方法进行较全面的比较.1 材料和方法1.1 材料近交系 SPF 级 68 周龄 Wistar 大鼠 20 只，雌雄不拘，体质量 120150 g，由广东省动物中心提供. DMEMF12培养基（Gibco 公司） ，胎牛血清（Hyclone 公司） ，CFSE（Sigma公司） ，BrdU（Sigma 公司） ，小鼠抗BrdU 抗体（Chemicon 公司） ，山羊抗小鼠FITC （Santa Crutz 公司） ，AdGFP （珠江医院妇产科构建） ，CCK8 试剂盒（D
11、ojindo 公司） ，磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德公司）. CO2 培养箱（ Shell 公司） ，荧光显微镜（Leica 公司） ，流式细胞仪（Becton Dickinson 公司）.1.2 方法1.2.1 大鼠 MSCs 的分离、培养及扩增用 100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠后，无菌条件下取出胫骨和股骨，制备单细胞悬液，小心加入预先有密度为 1.083 的 Percoll 分离液的离心管内，两种液体体积比为 11. 离心后，小心吸取中间界面乳白色的单个核细胞层，5用 PBS 洗 2 次后加完全培养基（含 100 mL/L 胎牛血清的DMEM/F12 培养基）重悬，接种培养. 待细胞
12、铺满瓶底的 80%90%时，按 12传代. 本实验中选用生长良好的第 3 代大鼠 MSCs.1.2.2BrdU 标记方法及标记率的检测待细胞长至约 50%融合时，吸弃培养基，加入 BrdU 浓度为 10 mol/L的培养基，置培养箱中孵育 48 h. 弃去培养基，PBS 清洗，以 40 g/L 多聚甲醛固定30 min. 再用 PBS 清洗 3 次后，加入 10 g/L 牛血清白蛋白，甩净余液后，加入小鼠的抗 BrdU 抗体，于湿盒中 37孵育 4 h，PBS清洗 3 次后，避光加入山羊抗小鼠 FITC 荧光抗体，避光孵育 1 h， PBS 清洗 3 次后，荧光显微镜下观察细胞的即时标记情况.
13、 随机选取 5 个视野，平均标记率，即为 BrdU 的即时标记率. 同批 BrdU标记的大鼠 MSCs 继续培养、传代，分别于 15，30 d 后再检测标记率.1.2.3CFSE 标记方法和标记率检测待大鼠 MSCs 长至约铺满瓶底的 80%时，加入 CFSE，并使其终浓度为 5 mol/L，置培养箱中继续孵育 40 min. PBS 洗 3 次后，流式细胞仪检测荧光标记率，以未标记的 MSCs 作为对照. 同批 CFSE 标记的大鼠 MSCs 继续培养、传代，分别于 15，30 d 后再检测标记率.1.2.4AdGFP标记方法和标记率的检测取病毒储存液在6HEK293细胞中反复扩增，收集培养
14、上清及细胞，反复冻溶破坏细胞离心取上清、过滤除菌，氯化铯密度梯度离心法进行纯化，空斑实验法测定转染液病毒滴度为 21013 pfuL. 待大鼠 MSCs 长至约铺满瓶底的 80%时，加入感染复数（multiplicity of infection，MOI ）为 100 的 AdGFP，并于 12，24，48 和 72 h，于荧光显微镜下观察标记情况. GFP 标记 72 h 后，以未标记的MSCs 做对照，用流式细胞仪进行荧光标记率检测. 同批 GFP 标记的大鼠 MSCs 继续培养、传代，分别于 15，30 d 后再检测标记率.1.2.5 细胞周期和凋亡率的检测标记后 24 h， MSCs
15、经胰酶消化后，以 PBS 重悬为细胞密度为 1109/L 的单细胞悬液，用流式细胞仪检测不同方法标记的 MSCs 的细胞周期和凋亡率.1.2.6 表面标志检测三种方法标记及未标记的大鼠 MSCs 分别用胰酶消化、PBS 洗涤后制成 109/L 的单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞表面 CD29，CD34 ，CD44，CD45 的表达.1.2.7 细胞增殖能力检测应用 CCK8试剂盒检测分别用三种方法标记及未标记大鼠 MSCs 的增殖能力，并绘制生长曲线. 于 96孔板的每个孔中加入 100 L细胞悬液，细胞数为 1103 个. 于细胞接种后的 7 d 内，每天取 5 个孔进行检测，每个孔内加入CC
16、K8试剂 10 L，置培养箱内孵育 4 h 后，用全自动酶标仪检测A450 nm 值. 取其均值，以培养时间为横坐标，以相应的 A450 7nm 为纵坐标，描绘生长曲线.统计学处理：数据以 xs 表示，用 SPSS12.0 统计软件处理，采用单向方差分析（Oneway ANOVA） ，组间比较采用多重比较SNK 法.2 结果2.1 大鼠 MSCs 培养接种后 24 h，细胞为圆形，部分细胞贴附于瓶底，折光性较强. 72 h 后绝大部分细胞贴壁，梭形，呈集落样生长，折光性差. 培养 710 d 后，集落增多融合成片，铺满瓶底的 80%，可进行细胞的首次传代. 传 34 代后，细胞为长梭形，形态均一，排列有序（图 1）.2.2 三种方法的标记率三种方法的即时标记率、15 d 标记率和 30 d 标记率见表 1. AdGFP感染大鼠 MSCs 后 24 h 即可见到有绿色荧光蛋白的表达，以后逐渐增强，72 h 可见到较强的
