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1、第九节 工业微生物菌种保藏技术,在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。,一、理想的菌种保藏方法应具备的条件,(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,一、微生物菌种保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保
2、藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。 对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,国际重要菌种保藏机构,中国菌种保藏单位,二、工业微生物菌种保藏技术,(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3)转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。,菌种保藏方法,暂时保藏法 斜面传代法 穿刺法,长期保藏法 液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法,2.1 冷冻保藏,冷冻保
3、藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。,冷冻保藏种类,一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术,普通冷冻保藏技术(-20),将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后
4、，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。,应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。,二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80),要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。,如果待保藏菌种生长在斜面上，
5、则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。,三、液氮冷冻保藏技术,(一)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。,(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。,(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在
6、浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。,2控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；,(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达-50；(6)将
7、安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 气相(-156)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。,(三)复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。,2.2 冻干保藏,冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻
8、保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。,培养物的冻干过程,冷冻真空干燥操作流程,安培瓶,(三)冻干菌种的保藏与再生,1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。,(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，
9、或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。,2.3传代保藏,将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。,2.3 传代培养法,实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保
10、存期。,操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存24个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。,2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按
11、穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4冰箱存放。,矿物油中浸没保藏,将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。,浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了
12、预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。,2.4 载体法,实验原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤 纸片等。,操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至
13、可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。,2.4 基因工程菌的保藏,由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。,当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。,不同菌种保藏方法比较,细菌的保藏,放线菌菌种的
14、保藏,保藏方法主要有：沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法,放线菌菌种的长期保藏依保藏放线菌的分生孢子为主要方式。,2.5 微生物活力和稳定性测定,所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。,对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。,加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
15、成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。,第十节 菌种的衰退与复壮,在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。,在长期接触菌种的实际工作人员中，都有这样的体会，即如果对菌种工作长期放任自流，不搞纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，反映到生产上就会出现持续的低产、不稳产。这说明菌种的生产性状也是不进则退的。,菌种衰退的表现,对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。生长速度缓慢，产孢子越来越少。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。,
