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1、1非洛地平对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用作者：祁杰，盛婴，郑见宝，袁祖贻【摘要 】 目的 研究非洛地平(felodipine)对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活性氧(ROS) 及细胞间粘附分子1(ICAM1) 、血管细胞粘附分子1(VCAM1)mRNA 表达的影响，探讨其独立于降血压外的抗动脉粥样硬化的作用机制。方法 筛选 oxLDL 与 HUVECs 细胞孵育最适的干预浓度梯度与时间，然后与不同浓度的非洛地平(0.1、1 、10mol/L)共同孵育24h，流式细胞仪测定细胞内 ROS，real timePCR 检测细胞ICAM1、VCAM1mR
2、NA 的表达。结果 oxLDL 对 HUVECs 内ROS 的产生呈浓度依赖效应，随着刺激浓度的升高，ROS 产生增多，25mg/L oxLDL 作用最为显著(P0.01)，非洛地平可抑制oxLDL 诱导的 HUVECs ROS(P0.05)的产生;随 oxLDL 刺激浓度的增加，ICAM1 、VCAM1 mRNA 表达逐渐上调，当浓度达到 25mg/L 时，作用最为显著(P0.05)，非洛地平可下调ICAM1、VCAM1 mRNA 的表达(P0.05)。结论 非洛地平可抑制 oxLDL 诱导的 HUVECs ROS 的产生以及下调ICAM1、VCAM1 mRNA 表达，发挥抗氧化抗炎的内皮保
3、护功能。 J2【关键词】 非洛地平;氧化型低密度脂蛋白;氧化应激;动脉粥样硬化; 人脐静脉内皮细胞; 细胞间粘附分子1; 血管细胞粘附分子1ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of felodipine on reactive oxygen species (ROS) generation, mRNA level of inflammatory factors such as intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) and vascular cell adhesion mol
4、ecule1 (VCAM1), in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL) so as to explore felodipines antiatherosclerosis mechanism independent of its antihypertensive effect. Methods Isolated HUVECs were treated with oxLDL at different concentrations (6,
5、 12.5 and 25mg/L) for 24 hours so that the optimal concentration and time of oxLDL treatment were selected. Then the cells were incubated with oxLDL and treated with felodipine at different concentrations (0.1, 1 and 10mol/L). Intracellular ROS level was determined by flow cytometry (FCM). Expressio
6、ns of inflammatory factors ICAM1 and VCAM1 were measured by real timepolymerase chain reaction (real timePCR). Results ROS generation was increased in HUVECs J3after treatment with different concentrations (6, 12.5 and 25mg/L) of oxLDL for 24 hours and there was a significant difference at 25mg/L ox
7、LDL (P0.01); ROS generation was decreased after felodipine treatment for 24 hours (P0.05). The mRNA expression of ICAM1 and VCAM1 in HUVECs during treatment with 25mg/L oxLDL was significantly higher than that in the control group (P0.05), but ICAM1 mRNA and VCAM1 mRNA expressions were significantly
8、 downregulated during treatment with 0.1mol/L felodipine (P0.05). Conclusion Felodipine has an antiatherosclerosis endothelial protective effect. The antioxidation and antiinflammation mechanism may be related to its inhibiting HUVECs ROS generation induced by oxLDL as well as downregulating ICAM1 a
9、nd VCAM1mRNA expressions.KEY WORDS: felodipine; oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL); oxidative stress; atherosclerosis; human umbilical vein endothelial cell; intercellular adhesion molecule1 (ICAM1); vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1)动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症反应过J4程1。但是，其发病机制目前还不十
10、分清楚。近年来，从信号传导和基因调控水平的研究揭示了氧化应激和炎症是 As 发生的两个关键成分。这两个看似不相关的独立致病因素却是相互调控,共同存在的。钙通道阻滞剂独立于降压以外的多效作用备受关注,其中抗 As作用尤其受到重视。非洛地平(felodipine) 是第 2 代长效 1，4 二氢吡啶类钙通道阻滞剂，已作为高血压病的首选药物在临床广泛应用。我们前期研究发现非洛地平可减轻高脂饮食喂养的兔主动脉粥样硬化病变2。本实验试从细胞水平探讨非洛地平的抗 As 作用及可能的机制，为临床应用提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料 M199 培养基购自 GIBCO 公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物
11、研究所;非洛地平原粉、溶剂二甲亚砜(DMSO)、2 ，7二氯荧光素二乙酸脂(DCFHDA) 购自 Sigma 公司;总 RNA 提取试剂(Trizol)购自 Invitrogen 公司; 逆转录 聚合酶链反应试剂盒为美国Promega 公司产品; 兔抗人因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司;DNA 荧光染料(SYBR Green)购自TaKaRa 公司;引物由上海生物工程有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。本实验选用原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein J5endothelial cells, HUVECs)，标本来自于西安交通大学医学院
12、第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带放入无菌容器中，3h 内行脐静脉内皮细胞的分离培养。置于50mL/L CO2、37培养箱中孵育，待原代培养细胞生长至80%90%融合后进行传代培养。将原代和传至第 3 代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待细胞均匀铺满孔底吸出培养液，用 PBS 冲洗盖玻片，冷风吹干后-20低温冰箱中冻存，用于因子相关抗原的检测。第 4 代细胞用于实验。氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, oxLDL)的制备：采用一次性密度梯度超速离心法分离 LDL。新鲜健康人血浆购自血库。血浆在密度为 1.063
13、和 1.020 的密度梯度液中，于 4、50000r/min 离心 5h。分离出的 LDL 在 4 的 LDL 透析液中透析 36h，用 0.45m 微孔滤膜除菌保存。将已氧化的 LDL在无 EDTA 的 PBS 中 4 透析 36h，然后加入含 CuSO4 PBS 液，37氧化 18h。再置于 PBS 液中透析 24h。于 4 避光保存，备用。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定 LDL 和 oxLDL 的纯度。用硫代巴比妥酸反应法测定 LDL 和 oxLDL 的丙二醛含量以确定其氧化修饰程度。1.2 方法1.2.1 细胞培养 取第 3 代 HUVECs 于 37、50mL/L CO2J6培养箱孵育，然后
14、传代、消化，接种在 6 孔培养板中，观察细胞生长融合约 80%后，换成含 100mL/L 胎牛血清的培养液继续培养24h，应用不同浓度的 oxLDL 孵育 3 代细胞，同时加用不同浓度的非洛地平进行干预，孵育 24h。实验分组： 空白组：M199 培养基与 100mL/L 胎牛血清;oxLDL 组(As 模型)：分别加入oxLDL 6、12.5、25mg/L 孵育 24h; 非洛地平组：0.1、1、10mol/L 非洛地平分别与 25mg/L oxLDL 孵育 24h;溶剂对照组：DMSO。1.2.2 内皮细胞 因子相关抗原的检测 采用免疫荧光染色。取出冻存的盖玻片，加入 40g/L 多聚甲醛
15、固定 30min，PBS 冲洗，滴加 110 兔抗人因子抗体血清，再滴加 1100 荧光素标记的羊抗兔免疫荧光抗体，同时设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍照。1.2.3 细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的测定 按照 11000 用无血清培养液稀释 DCFHDA; 去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFHDA 1mL;37细胞培养箱内孵育 20min;流式细胞仪检测细胞荧光强度，以 CELL QuestTM软件分析平均荧光强度。1.2.4 实时荧光定量 PCR 检测细胞间粘附分子1(ICAM1) 、血管细胞粘附分子1(VCAM1)mRNA 的表达 RNA 的提取：参J7照 Trizol 试剂盒说明书提取 RNA，所用器皿均用 1g/L DEPC 水处理，以防止 RNA 酶污染 ; 逆转录合成 cDNA：按照 Promega 逆转录 聚合酶链反应试剂盒说明书在 PCR 仪上进行逆转录合成cDNA;引物的设计与合成：扩增引物序列为：GAPDH 正义引物5CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAG3，反义引物5GTGGAATCATATTGGAACATGTAG3;ICAM1 正义引物5CCGGAAGGTGTATGAACGT3，反义引物5TCCATG
