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1、1非创伤性股骨头缺血性坏死发病机制的分子生物学研究进展作者：张雷，杨国敬，郑进佑，王珺【关键词】 非创伤性 股骨头缺血性坏死 发病机制 分子生物学股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH) 是骨科临床较常见的进展性疾病。大体可以分为创伤性和非创伤性ONFH，病因复杂，病程缓慢，治疗困难，致残率高，是医学领域尚未攻克的难题。近些年来，非创伤性 ONFH 的发病率呈上升趋势，引起广泛的关注。创伤性 ONFH 的发病原因比较明确，一般认为外伤导致股骨头营养血管血流的直接中断从而继发骨细胞的坏死；而非创伤性ONFH 的发病是多因素作用下的复杂病理过程，发病
2、机制研究由于缺乏理想的动物模型和纵向比较研究，虽取得了很多进展，但仍处百家争鸣的现状。利用分子生物学技术以明确非创伤性 ONFH 相关的发病机制，可能开拓本病研究的新方向。1 非创伤性 ONFH 与凋亡2传统观点认为 ONFH 在细胞水平上的病理变化主要是骨组织的“坏死” 。但学者们发现在 ONFH 的病理切片上却只表现为骨细胞消失，骨陷窝空虚，并没有明显的炎症细胞浸润。随着“细胞凋亡”的发现，人们在对“坏死”和“凋亡”两种细胞死亡方式的出现时间对比后，开始对 ONFH 的概念提出质疑，并就 ONFH 后早期的病理过程进行重新思考。Sato 等1经观察大鼠创伤后 ONFH 的病理变化，发现确实
3、有细胞凋亡的参与。在创伤后仅 3 h 就检测出凋亡相关基因(ORPl50 和 HO1)的 mRNA 表达；而组织学变化则开始于 12 h 以后，表现为可见的凋亡小体形成，整个凋亡过程在 24 h 左右达到高峰，而在伤后 4 d 逐渐减少和消失。 Sato 指出 ONFH的命名有误：一方面细胞死亡确实遵循了凋亡的途径，没有证据表明细胞发生了坏死；另一方面，没有出现组织坏死中常见的细胞肿胀和炎症细胞浸润现象。在激素引起的非创伤性 ONFH 的动物试验研究中，有人也比较明确地验证了凋亡和非创伤性 ONFH 的关系，并认为在激素性骨坏死的早期，细胞死亡主要是通过凋亡的方式进行。Kabata 等2对早期
4、激素性 ONFH 的兔模型利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediate ddUTP nick end labeling，TUNEL)也证实了细胞凋亡的存在。Weinstein 等3首次对 ONFH 患者术后的股骨头骨组织应用 TUNEL 法进行了凋亡细胞的检测，发现在激素3性 ONFH 的软骨下骨骨折周围(新月体处)有大量的骨细胞和成骨细胞凋亡，酒精性坏死的股骨头中也有少量凋亡细胞。此外，还有学者在基因和信号传导通路水平对激素诱导的细胞凋亡进行深入研究。Tsuji 等4运用 cDNA 阵列
5、和 RT-PCR 等技术利用体外培养的大鼠成骨细胞株研究激素对成骨细胞凋亡的作用，发现大剂量的激素在组织缺氧状态下可导致凋亡调节基因(p53、Bax、Bcl-2 和MDM2)明显的改变从而诱导细胞凋亡。迄今为止关于 ONFH 细胞凋亡的研究大都基于动物实验，人体骨组织的细胞凋亡研究将是非创伤性 ONFH 发病机制未来研究的重点方向。2 非创伤性 0NFH 与血管内皮细胞大量的研究资料表明，血管因素所致的缺血缺氧在非创伤性股骨头缺血坏死的发病中起重要作用。常见的内皮源性心血管活性物质包括内皮素-1(ET-1) 和血管内皮舒张因子(NO)。ET-1 是人体内最强的收缩血管物质，其对微血管的收缩作用
6、远远强于大血管。早在1998 年，Brcsk 等5就发现激素可以增加内皮素受体A(EDAR)的 mRNA 表达水平，同时血浆 ET-1 水平也明显增高。Drescher 等6在对猪骺外侧动脉的研究中发现激素治疗组 ET-1引起的血管收缩强度明显高于对照组。他们认为 ET-1 含量升高，可4以使血管强烈收缩，在股骨头内形成高灌低排、髓内血液淤滞、骨内高压及血液高凝，易于形成血栓。尤其是微血管收缩直接影响股骨头微循环和物质代谢；同时 ET-1 还促使血管平滑肌、内膜增生肥厚，导致管腔狭窄，更易栓塞。上述病理改变将严重影响股骨头血液循环和营养供应，最终导致股骨头缺血坏死。NO 是近年来发现的由血管内
7、皮细胞分泌的重要血管活性物质，具有舒张血管平滑肌、抗血小板粘附聚集等作用。1990 年 DiRosa等7发现激素可以通过抑制一氧化氮合酶(NOS) 的活性而使 NO合成减少，但未阐明非创伤性 ONFH 与 NO 之间的确切关系。国内外不少学者均发现激素性和酒精性 ONFH 病人血浆中的 NO 含量明显减少8、9 。但是，Calder 等10的一项新型研究却发现了相反的结果：他发现在坏死股骨头局部骨组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达显著增加，局部 NO含量增加，同时伴随凋亡细胞的增多。实验结果说明 eNOS 的表达增加反映了局部骨组织重塑形的活跃；而成骨细
8、胞和骨细胞中iNOS 高表达导致坏死区域 NO 产物合成增加，局部高 NO 的毒性作用通过诱导细胞凋亡并激活相应的炎症介质最终导致进行性的骨质破坏。尽管 Calder 的研究很好地解释了骨坏死区域自股骨头向股骨近端发展的原因，但目前血浆与骨组织 NO 水平存在差异的原因尚未明确，还有待进一步的研究。5血管内皮生长因子(VEGF) 能特异地作用于血管内皮细胞，促进其增殖和血管生成，在人体生理及病理血管生成中发挥关键性作用。最近的不少研究发现 ONFH 的病变过程中存在 VEGF 的参与。Suzuki11已发现了 VEGF 可以促进 ONFH 局部区域的新生血管形成。但是不少学者在 VEGF 的实
9、验研究上面却发现了不同的结果。国内赵宏斌等12发现在 ONFH 动物模型股骨头内的 VEGF基因表达受到抑制，血管再生极慢使骨修复能力明显下降，新骨形成也明显减慢。而 Radke 等13应用免疫组化技术却在从ONFH 患者取出的骨组织中不仅观察到 VEGF 的高表达，同时也发现了其他促血管生成物质如血管诱导生成因子 61(CYR61)和结缔组织生长因子(CTGF)表达增高，他认为股骨头缺血缺氧后可导致骨组织血管化再生增加，骨修复能力增强。因此，ONFH 不同时期是否存在 VEGF 基因表达的差异仍有待探索。3 非创伤性 ONFH 的基因组学研究早期对非创伤性 ONFH 的基因学研究都是建立在血
10、管内凝血机制的实验基础之上。有关于 Perthes 病的研究结果差异较大。Arruda 等14认为 Perthes 病与凝血因子 VLeiden 突变有关，但与凝血酶原 20210 基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因 C677T无关。Lopez-Franco 的研究发现 Perthes 病与凝血因子 VLeiden突变、凝血酶原 20210 基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因6C677T 均无显著相关15 。另外 Dilley 等16 新发现了纤维蛋白原基因 pG-455-A 多态性是 Perthes 病的一个重要危险因素。基于对 Perthes 病的研究结果，Ekmekci 等17 在成人同种异
11、体肾移植术后 ONFH 病人发现其与凝血因子 VLeiden 突变和凝血酶原20210 基因突变存在明显相关；Biorkman 等18 进一步研究发现成人特发性 ONFH 病人发生凝血因子 VLeiden 突变和凝血酶原20210 基因突变的频率远高于激素性和酒精性 ONFH。而 Celik 等19的另一项研究却未能发现同种异体肾移植术后成人 ONFH 与凝血因子 VLeiden 突变、凝血酶原 20210 基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因 C677T 的相关性。近年 ONFH 其他有关基因组学和转录组学的研究也取得了突破性进展。Li 等20发现激素的应用促使骨细胞内 PPARgamma2基因
12、的表达增加了 2 倍， CbfalRunx2 及骨钙蛋白基因表达下降了近 50%，结果使骨髓内未定型的骨祖细胞向脂肪细胞分化导致最终发生骨坏死。Liu 等21发现部分家族性 ONFH 与 12 号染色体的基因突变有关，他们对 3 个常染色体显性遗传的 ONFH 家族所有成员的 12q13.11-q13.2 区域的 COL2A1 基因进行 DNA 测序分析，发现所有发病者 COL2A1 基因的外显子均出现碱基转变，从而使表达型胶原 GXY 区域的核苷酸序列发生改变导致软骨中型胶原功能缺损。他们认为 COL2A1 的基因突变在 ONFH 的发病机制上起了至关重要的作用。此外，Hirata 等 22
13、还通过 PCR-RFLP7和 RT-PCR 的方法检测肾移植术后 ONFH 病人的 ApoAl 和 ApoB基因，认为 ApoBC7623T 与 ONFH 存在显著相关，并认为ApoBC7623T、BCBlC3435T 和 CBP(rs3751845)可作为肾移植术后发生 ONFH 的预测因子。多项药物基因组学的研究还发现 ONFH 与特定的遗传多态性有关。Chao 等23对酗酒合并 ONFH、胰腺炎、肝硬化病人的多种乙醇代谢酶进行测定，在骨坏死组中等位基因 ADH2*1 出现的频率低于肝硬化组，但与胰腺炎组比较未见明显差异；然而在同时合并骨坏死与肝硬化的病例中等位基因 ADH2*1 出现频率
14、比同时合并骨坏死及胰腺炎组高。作者认为这种差别与病例之间其他方面的遗传变异有关。另有作者认为药物转运蛋白 P-糖蛋白可以解释为何高剂量的糖皮质激素容易引起骨坏死，他对 136 例肾移植病人中 30例出现 ONFH 的病人的多元耐药基因 1 (ABCBl，MDRl)进行单核苷酸多态性评估，发现 ABCBl 3435TT 基因型的病人骨坏死的发生率较低，而在 ABCBl 3435CC 及 3435CT 基因型的病人中其发生率显著增高，作者提供了在 3435TT 基因型病人中 P糖蛋白活性增加的证据，并可以解释细胞内特定组织中类固醇增高的原因。这不仅为了解激素相关性骨坏死的发病机制提供了理论依据，更
15、有利于筛查高危人群24 。4 非创伤性 ONFH 与蛋白质组学研究8国内外对 ONFH 的发病机制的研究仍处于探索阶段。以往细胞学、基因组学平台上的研究已不能满足探索 ONFH 未知领域的要求，人们迫切地需要新兴的分子生物学技术来开拓一个崭新的科技研究平台，蛋白质组学由此应运而生。目前蛋白质组学在临床医学领域上已有较广泛的应用，尤其在泌尿系统肿瘤、消化道肿瘤方面，国内外已利用生物质谱技术完成对人类常见疾病如肝癌细胞系蛋白质的肽段分析，并成功地找到相关的血清标志物。然而蛋白质组学在 ONFH 的相关研究甚少。国内有人最近通过双向凝胶电泳(2-DE)及 MALDI-TOFMS 的方法在ONFH 的
16、血清中筛选出部分可能有意义的血清标志物 t-PA、PAI-1和抗 p53 抗体25 ，为将来筛选骨细胞中的差异表达蛋白提供了良好的基础。由于常规的差异表达蛋白的研究建立在 2-DE 技术和生物质谱技术的基础之上，而 2-DE 存在了低分子量检测和低丰度蛋白质的灵敏性等问题，因此建立一条研究 ONFH 高通量蛋白质组学的技术路线将是未来非创伤性 ONFH 基础研究的发展方向。【参考文献】 1 Sato M, Sugano N, Ohzono K，et al.Apoptosis and expression of stress protein (ORP150, HOI) during development of ischaemic osteonecrosis in the ratJ. J Bone Joint SurgBr ，2001，83:4751-4759.92 Kabata T,
